SZDBZ 208-2016 H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR 检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 SZDB/Z 深 圳 市 标 准 化 指 导 性 技 术 文 件 SZDB/Z 208-2016 H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Protocol of Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for Detection of Avian Influenza H7N9 Virus 2016-11-22 发布 2016-12-01 实施深圳市市场监督管理局发 布 SZDB/Z 208-2016 I 目 次 前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 术语与缩略语.14 原理.15 仪器与试剂.26 生物安全要求.27 样品采集和前处理.2 8 核酸提取.39 实时荧光 RT-PCR 检测.3 10 分析条件设定和结果判定.4附录 A（规范性附录）常用试剂配制.5 附录 B（资料性附录）H7N9 禽流感 H7 和 N9 的引物及探针.6 附录 C（资料性附录）实时荧光 RT-PCR 反应体系配制.7 SZDB/Z 208-2016 II 前 言 本文件按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本文件的某些内容有可能涉及专利，应按照专利法的规定执行。本文件的发布机构不应承担识别这些专利的责任。本文件由深圳市检验检疫科学研究院提出。本文件起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心、中华人民共和国江西出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检疫局 本文件主要起草人：廖立珊、孙洁、叶奕优、林庆燕、秦智锋、曾少灵、杨春华、刘建利、唐金明、花群义、吕建强、杨俊兴、曹琛福、卢体康、阮周曦、陶虹、张彩虹、陈兵、罗宝正。SZDB/Z 208-2016 1 H7N9 亚型禽流感病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本文件规定了H7N9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR的检测方法。本文件适用于快速检测咽拭子、鼻拭子、泄殖腔拭子、组织样品等临床样品中H7N9亚型禽流感病毒。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 GB 19442 高致病性禽流感防治技术规范 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语与缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值 Cycle threshold，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数 DEPC diethylprocarbonate，焦碳酸二乙酯 PBS phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液 FAM 6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素 RT-PCR reverse transcription Polymerase Chain Reaction,反转录聚合酶链式反应 4 原理 采用TaqMan方法，选择H7N9 毒株序列相对最保守的HA基因和NA基因作为H7N9 检测的靶序列。采用DNAMAN软件对Genebank公布的所有序列进行Blast比较后，分别在各自的高度保守序列内进行引物和探针的设计。该探针的结合部位位于目的扩增片段内部。其中5 端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3 端标记BHQ荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5 端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时，Taq酶发挥53的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长，根据荧光信号的强弱来进行结果判定。5 仪器与试剂 SZDB/Z 208-2016 2 5.1 仪器与材料 实时荧光PCR仪；高速冷冻离心机（最高离心力达15 000 g 以上）；生物安全柜；混匀器；冰箱（28，-20，-80）；微量可调移液器（10 L,100 L,1000 L）；微量带滤芯吸嘴（10 L,100 L,1000 L）；灭菌研钵；离心管；PCR光学反应管。5.2 试剂 5.2.1 试剂级别 除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T 6682规定的一级水，所用化学试剂均为分析纯。5.2.2 引物与探针 H7N9 禽流感H7 和N9 的引物及探针（附录B）。采用无DNA酶、无RNA酶水将每条引物与探针配制成100 mol/L储存液，置-20或更低温度冻存。使用时取适量配制成10 mol/L工作液，避免多次冻融。5.2.3 一步法实时荧光 RT-PCR 检测试剂盒。5.2.4 阳性对照为灭活疫苗，-20保存备用。阴性对照样品为 SPF 动物的拭子样本或组织悬液，空白对照样品为试剂盒本身试剂不加模板。5.2.5 其他试剂 DEPC 水(按照附录 A 制备，推荐使用商品化 DEPC 处理的无 DNA 酶和 RNA 酶的水)；三氯甲烷；异丙醇；无水乙醇；70 乙醇（用新开启的灭菌双蒸水配制，-20预冷）；0.01 mol/L PBS（pH7.2，配制方法见附录 A）。6 生物安全要求 样品采集、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应参照 GB 19489 的规定进行。7 样品采集和前处理 7.1 样品采集 7.1.1 一般要求 样品的采集、保存及运输应符合 GB/T 18088、GB/T 18936 和 GB 19442 的相关要求。7.1.2 禽的相关病毒样品采集 将两个灭菌的棉拭子于 PBS 溶液中浸湿，取一个棉拭子先插入活禽喉头口及上腭裂来回刮 35 次并慢慢旋转 23 次，取咽喉分泌液；再将另一个棉拭子插入该禽的泄殖腔内 1.5cm2cm 轻轻擦拭 35 次并旋转 23 次；将咽喉拭子和泄殖腔棉拭子一起放入盛有 1mL 灭菌的 0.01 moL/L pH7.2 PBS(内含青霉素 2000 IU/mL，链霉素 2 mg/mL)中，加盖、编号，为一个活禽样。小珍禽采咽喉/泄殖腔拭子容易造成伤害，可随机采集 5 个新鲜粪便样品，每个样品 12 g。7.1.3 人的相关病毒采 SZDB/Z 208-2016 3 采集被采样人员的咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰等物品。样品不得混合，每个被采样人员的样品需单独检测。7.1.4 其他动物的相关样品采集 参照 7.1.27.1.3 执行。7.2 样品的保存和运输 待检样品在 28保存不应超过 24 h；-20保存不超过三个月；-80以下可长期保存。样品应置于低温、密封的容器内运输。7.3 样品制备 将采集的样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后，于离心机中瞬时离心。8 核酸提取 8.1 核酸抽提（酚氯仿法）a)取灭菌的1.5 mL离心管，做好标识。b)每管加入600 L裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200 L，再加入200 L氯仿，混匀器上振荡混匀5 s，于4 12000 g 离心15 min。c)取灭菌的1.5 mL离心管，加入-20预冷400 L异丙醇，吸取上一步各管中的上清液转移至相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀于4 12000 g离心15 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入600 L 75预冷乙醇，颠倒洗涤。d)于4 12000 g离心10 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。e)10000 g离心10 s，用微量加样器将其吸干，室温干燥（510）min。f)加入15 L DEPC水，溶解管底的RNA，5000 g离心5s，冰上保存备用，若需长期保存应放置-80 冰箱。8.2 其他核酸抽提方法 H7N9 亚型禽流感病毒核酸提取也可以采用等效 RNA 提取试剂及方法:如采用自动化核酸抽提仪和配套核酸抽提试剂进行核酸抽提。9 实时荧光 RT-PCR 检测 9.1 反应体系配制 在PCR溶液配制区，参照各试剂盒说明书进行配制，每份检测样品的实时荧光 RT-PCR体系为25 L（附录 C 以 AgPath-IDTM One-Step RT-PCR 试剂盒为例，列出反应体系配制表，仅供参考）将 配制的每个 PCR 反应试剂充分混匀，瞬时离心后转移至样本处理区。9.2 扩增检测 9.2.1 加样 SZDB/Z 208-2016 4 在已分装有 PCR 反应混合液的 PCR 管中分别加入已提取好的核酸 5 L，盖上管盖，混匀后瞬时离心，将 PCR 管放入荧光 PCR 检测仪内，记录样本放置顺序。9.2.2 PCR 扩增检测（扩增检测区）9.2.2.1 反应条件设定 a)取灭菌的 1.5 mL 离心管，做好标识。转录 45 30 min；b)热启动 95 10 min(不同的生产商家推荐的时间不同，应根据说明书进行)；c)95 15s，60 45s，40 个循环，60 时设置采集荧光。9.2.2.2 通道选择 报告荧光（Report Dye）设定为 FAM（或按探针实际标记的荧光基团设定），淬灭荧光（Quench Dye）设定为 None，校准荧光（Reference dye）设定为 None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。10 分析条件设定和结果判定 10.1 阈值设定 综合分析仪器给出的各项结果，基线（baseline）以仪器给出的默认值作为参考，阈值（Threshold）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照样品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择 FAM 或相应的通道进行分析。10.2 质控 阴性对照和空白对照应无 Ct 值并无典型扩增曲线，阳性对照的 Ct 值均应30，且呈现典型扩增曲线，有明显的对数增长期，才可判定试验成立，否则试验无效。10.3 荧光 PCR 结果分析及判定 10.3.1 阳性反应结果判定 在试验成立的条件下，H7 亚型和 N9 亚型检测结果同时呈现 Ct 值35 且呈现典型扩增曲线，判为荧光 PCR 阳性反应，表明 H7N9 亚型禽流感病毒核酸阳性。10.3.2 阴性反应结果判定 H7亚型和N9亚型检测经40个循环无Ct值且不出现扩增曲线，或者其中一个亚型为阳性，判为荧光PCR阴性反应，表明H7N9亚型禽流感病毒核酸阴性。10.3.3 有效原则 H7 亚型和 N9 亚型检测结果 Ct 值均35 的样品建议重做。重做结果无 Ct 值者为阴性，否则为阳性。SZDB/Z 208-2016 5 附 录 A（规范性附录）常用试剂配制 A.1 0.01 mol/L PBS(pH7.2)磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）1.80 g 氯化钾(KCl)0.20 g 氯化钠（NaCl）7.90 g 加三蒸去离子水 800 mL，完全溶解后用 HCl 调节溶液 pH 至 7.2，最后加三蒸去离子水定容至 1000 mL。经 121，15 min 高压灭菌，室温保存。A.2 DEPC水 每升三蒸水中加入1 mL DEPC，用力摇匀，使DEPC充分混匀在水中，37 放置12 h以上，再经121，15 min高压灭菌备用。SZDB/Z 208-2016 6 附 录 B（资料性附录）H7N9禽流感H7和N9的引物及探针 H7N9 禽流感 H7 和 N9 的引物及探针见表 B.1，探针 5端和 3端分别标记 FAM 和 BHQ，以下引物和探针均委托上海生工生物技术有限公司合成。表 B.1 H7N9 禽流感 H7 和 N9 的引物及探针 引物及探针 亚型 H7 N9 FP(5-3)AGA AAT GAA ATG GCT CCT GTC AA TAG CAA TGA CAC ACA CTA GTC AAT RP(5-3)GGT TT