DB61T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 B 16 DB61 陕西省地方标准 DB 61/T 11342018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法 Detection and identification of Tomato yellow leaf curl virus 2018-04-10 发布 2018-05-10 实施 陕西省质量技术监督局 发 布 DB61/T 11342018 I 目 次 前 言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 番茄黄化曲叶病毒基本信息.1 4 方法原理.1 5 实验用仪器设备、用具及试剂.1 6 取样和样品制备.2 7 检测方法.2 8 结果判定.2 9 结果记录与样品、资料保存.2 10 安全.3 附录 A（规范性附录）TYLCV 相关资料.4 附录 B（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法.7 附录 C（规范性附录）普通 PCR 检测方法.11 附录 D（规范性附录）实时荧光 PCR 检测方法.14 附录 E（规范性附录）生物学接种.16 DB61/T 11342018 II 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由陕西省农业厅提出并归口。本标准起草单位：陕西省生物农业研究所、陕西省园艺蚕桑技术工作站、陕西学前师范学院。本标准主要起草人：李英梅、杨苗苗、王周平、刘晨、张伟兵、张锋、洪波、陈志杰、张淑莲。本标准由陕西省生物农业研究所负责解释。本标准首次发布。联系信息如下：单位：陕西省生物农业研究所 电话：02982291059 地址：西安市咸宁中路125号 邮编：710043 DB61/T 11342018 1 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法 1 范围 本标准规定了番茄黄化曲叶病毒酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于番茄种苗及传毒介体中携带的番茄黄化曲叶病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 23629-2009 引进植物病原生物安全控制技术要求 3 番茄黄化曲叶病毒基本信息 中文名：番茄黄化曲叶病毒 英文名：tomato yellow leaf curl virus 英文缩写：TYLCV 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）番茄黄化曲叶病毒其他信息见附录A。4 方法原理 通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR进行检测鉴定。5 实验用仪器设备、用具及试剂 5.1 仪器设备 酶联检测仪、洗板机、高速冷冻离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电子天平（感量，1/10000g）、电泳仪、电泳槽、紫外投射仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、液氮罐、隔离温室等。5.2 用具 可调式微量移液器（0.5L、2L、10L、20L、100L、200L、1000L）、96孔光化学PCR反应板、酶联板、离心管、PCR管、研钵等。5.3 试剂 酶联测定试剂，PCR检测试剂，除有特殊说明外，均为分析纯或生化试剂。DB61/T 11342018 2 6 取样和样品制备 6.1 取样 6.1.1 疑似被 TYLCV 感染的番茄植株取样方法：取疑似发病植株顶部叶片 2 片3 片，-20储存备用。6.1.2 无 TYLCV 感染症状番茄植株取样方法：在番茄田随机选 5 点，每点随机选 5 株，每株取顶部叶片 2 片3 片，-20储存备用。6.1.3 若在取样过程中发现烟粉虱，应随机采集烟粉虱，-20储存备用。6.2 实验室样品制备 6.2.1 植物样品：将每份 10g 待测番茄叶片放入研钵后加入液氮研磨，取 100mg 按照植物基因组试剂盒抽提番茄叶片总 DNA，-20保存所提 DNA。6.2.2 烟粉虱样品：取单头烟粉虱按照动物基因组提取试剂盒抽提 DNA，-20保存所提 DNA。7 检测方法 7.1 酶联免疫吸附测定方法见附录 B。7.2 PCR 检测方法见附录 C。7.3 实时荧光定量 PCR 检测方法见附录 D。7.4 生物学测定方法见附录 E。8 结果判定 8.1 样品经酶联免疫吸附、普通 PCR、实时荧光定量 PCR 三种方法之一检测为阴性时，判定样品不携带 TYLCV。8.2 普通 PCR、实时荧光定量 PCR 中的两种方法检测结果为阳性，应进行序列测定，如序列测定结果证实与所检测的 TYLCV 一致，即可判定检出 TYLCV。8.3 酶联测定为阳性后，普通 PCR 或实时荧光 PCR 检测结果为阳性可判定检出 TYLCV。必要时可进行生物学测定，并进行复检。9 结果记录与样品、资料保存 9.1 结果记录 检验结果应形成检验报告，内容包括取样品种、时间、地点、人员、样品类型，样品保存条件；实验时间、地点、方法、结果，检验人员签字等。9.2 样品保存 经检验确定携带TYLCV的样品保存在-80冰箱，标记样品并登记。9.3 资料保存 酶联测定需有酶联极反应的原始数据，普通PCR检测需有电泳结果照片及序列测定报告，荧光定量PCR检测需有扩增曲线图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状图片。DB61/T 11342018 3 10 安全 实验过程中的生物安全要求应严格按照GB 19489-2008的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T 23629-2009中相关要求进行处理。DB61/T 11342018 4 A A 附 录 A（规范性附录）TYLCV 相关资料 A.1 生物学特性 A.1.1 主要寄主作物 TYLCV的自然寄主有番茄（Lycopersicum esculentum Mill.）、烟草（Nicotiana tabacum）、茄子（Solanum melongena）、南瓜（Cucurbita moschata）、木薯（Manihot esculenta crantz）、棉花（Gossypium hirsutum）、辣椒（Capsicum annuum L.）等。A.1.2 野生寄主 野生寄主有曼陀罗（Datura stramonium）等。A.1.3 病毒侵染部位 茎秆、叶片、果实。A.2 病害症状 A.2.1 番茄受害症状：寄主植株感染TYLCV后，初期主要表现生长迟缓或停滞，顶部叶片常退绿发黄，变小变厚，叶质脆硬，叶片有褶皱、向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化节间变短，植株明显矮化，下部老叶症状不明显（见图A.1、图A.2）；番茄植株具有明显曲叶症状外，后期表现坐果少，果实变小，膨大速度慢，成熟期的果实不能正常转色，果实产量和商品价值均大幅度下降。A.2.2 烟草受害症状：寄主植株感染病毒后，株叶脉增粗叶片脊面出现耳突，叶片有卷曲、黄化现象。A.2.3 辣椒受害症状：植株受害后，叶片卷曲、黄化。图A.1 TYLCV 侵染后的番茄叶片 DB61/T 11342018 5 图A.2 TYLCV 侵染后的番茄植株 A.3 分布区域 TYLCV主要分布于亚洲、非洲、欧洲、美洲、大洋洲。A.4 传播方式 烟粉虱（Bemisia tabaci）是唯一的传播媒介，各种生物型的烟粉虱均可传播。A.5 粒体形态 番茄黄化曲叶病毒粒体呈孪生颗粒状，大小约30nm20nm。A.6 基因组 为单链环状DNA，大小约为2.8kb，基因数6个，基因组含有4个ORFs（AC1，AC2，AC3，AC4）。DB61/T 11342018 6 B B 附 录 B（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法 B.1 材料 B.1.1 酶联板的要求 使用有质量保证厂商生产的酶联板。B.1.2 包被抗体 特异性的TYLCV抗体。B.1.3 酶标抗体 碱性磷酸酯酶标记的TYLCV抗体。B.1.4 底物 对硝基苯磷酸二钠（NPP）。B.1.5 样品抽提缓冲液。样品抽提缓冲液（pH7.4）应符合表B.1。表B.1 样品抽提缓冲液 试剂 用量 亚硫酸钠（Na2SO3）1.30g 聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000MW40000）20.0g 叠氮化钠（NaN3）0.20g 吐温（Tween-20）20mL 注：溶于900mL，1PBST中，NaOH或HCl调节pH值至7.4，定容至1000mL，4储存。B.1.6 包被缓冲液 包被缓冲液（pH9.6）应符合表B.2。表B.2 包被缓冲液 试剂 用量 碳酸钠（Na2CO3）1.59g 碳酸氢钠（NaHCO3）2.93g 叠氮钠（NaN3）0.20g 注：加入900mL蒸馏水溶解，HCl调节pH值到9.6。蒸馏水定容至1000mL，4储存。B.1.7 PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）DB61/T 11342018 7 PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）应符合表B.3。表B.3 PBST 缓冲液 试剂 用量 氯化钠（NaCl）8.00g 磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.15g 磷酸二氢钾（KH2PO4）1.20g 氯化钾（KCl）0.20g 吐温（Tween-20）0.50mL 注：加入900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCl调节pH值至7.4，用蒸馏水定容至1000mL，4储存。B.1.8 酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）酶标抗体稀释缓冲液（pH）应符合表B.4。表B.4 酶标抗体稀释缓冲液 试剂 用量 1PBST 缓冲液 800mL BSA（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉 2.0g PVP（MW24 000MW40 000）20.0g 叠氮钠（NaN3）0.2g 注：用NaOH或HCl调节pH值到7.4，用无菌蒸馏水定容至1000mL，4储存。B.1.9 底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）应符合表B.5。表B.5 底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）试剂 用量 氯化镁（MgCl2）0.1g 叠氮钠（NaN3）0.2g 二乙醇胺 97mL 注：溶解于800mL蒸馏水中，盐酸调pH9.8，蒸馏水定容至1000mL，4储存。B.2 程序 B.2.1 包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加入酶联板的孔中，100L/孔，加盖，37孵育4h或4冰箱中孵育过夜，清空酶联孔中溶液，PBST洗涤4次6次，每次3min。B.2.2 样品制备 待测样品按1:10（质量：体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，2000r/min，离心10min，上清液即为制备好的检测样品。样品提取缓冲液作空白对照，阴性对照作相应的处理或按照说明书进行。DB61/T 11342018 8 B.2.3 加样 加入制备好的检测样品、阴性对照，100L/孔，每一样品设一个重复。加盖后于4冰箱孵育过夜，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.4 加酶标抗体 用酶标抗体缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加入到酶联板中，100uL/孔，加盖，37孵育4h，酶联板用自来水彻底冲洗，再用蒸馏水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。B.2.5 加底物 将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现用现配），按100L/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育。B.2.6 读数 用酶联检测仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。或用肉眼观察显色情况。B.3 结果判断 B.3.1 对照孔的OD405值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD405值0.15，当阴性对照孔的OD405值0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应；阴性对照OD405值/阴性对照OD405值2；孔的重复性基本一致。B.3.2 在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：a)样品 OD405值/阴性对照 OD405值明显2，判为阳性；b)样品 OD405值/阴性对照 OD405值在阈值附近，判为可疑样品，需重新做