细胞因子检测技术.ppt

细胞因子细胞因子（cytokine,CK）指由免疫细胞或非免疫细胞（血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成与分泌的，具有多种生物功能的小分子蛋白质的统称。因能调节多种细胞的生理功能而得名。可介导细胞与细胞之间相互作用，介导炎症反应，参与免疫应答和组织修复等。细胞因子 一、细胞因子概述一、细胞因子概述 以生物学作用进行划分的分类以生物学作用进行划分的分类 白细胞介素（Interleukin）IL-1、IL-2、IL-18 干扰素（Interferon）IFN-、IFN-、IFN-肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor）TNF-、TNF-集落刺激因子（Colony-stimulating factor）M-CSF、G-CSF 转化生长因子（Transforming growth factor）TGF-趋化因子（Chemokine）IL-8、GROs、MCP-1 生长因子（Growth factor）EGF、FGF、IGF、PDGF 二、二、细胞因子检测的方法与原理细胞因子检测的方法与原理 （一）细胞生物学检测 （二）免疫学检测 （三）分子生物学检测 1、细胞增殖或增殖抑制试验 2、细胞毒活性测定 3、抗病毒活性测定法 4、细胞趋化活性测定法（一）细胞生物学检测（一）细胞生物学检测 1、细胞增殖和增殖抑制测定法、细胞增殖和增殖抑制测定法 以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过以细胞因子依赖性细胞株为靶向，通过观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性观察特定的细胞因子刺激或抑制依赖性细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。细胞株增殖来评估细胞因子的活性水平。常用的检测细胞增殖的方法有常用的检测细胞增殖的方法有3H-TdR掺掺入法、比色法、染色法和直接计数法入法、比色法、染色法和直接计数法等。等。其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的其中测定细胞代谢酶反应细胞增殖数的比色法包括比色法包括 MTT、XTT、MTS和和NAG等等方法。方法。通过检测细胞通过检测细胞DNADNA合成的增加或减少来判断细胞增殖的方合成的增加或减少来判断细胞增殖的方法。在细胞的增殖过程中，法。在细胞的增殖过程中，DNADNA合成的增加使得指示细胞对核合成的增加使得指示细胞对核苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素苷或碱基的需求增多，若将核苷标记上可以示踪的同位素（3 3H/H/125125I I），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞），通过检测细胞内的同位素含量，则可反映细胞增殖的程度。增殖的程度。结果客观易于自动化；结果客观易于自动化；适用于大标本量的测定适用于大标本量的测定 方法的特异性受依赖细方法的特异性受依赖细胞株影响；放射性污染胞株影响；放射性污染 (1)(1)放射性核素掺入法放射性核素掺入法 特点：不使用放射性核素，特点：不使用放射性核素，以细胞代谢变化为增殖指征以细胞代谢变化为增殖指征 指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关指示细胞的增殖情况与线粒体代谢活性相关 测定步骤类似测定步骤类似 与同位素掺入法相比与同位素掺入法相比 掺入物：掺入物：MTTMTT而非而非3 3H H-TdRTdR；反应条件：选用的细胞及其浓度、反应条件：选用的细胞及其浓度、培养时间不同培养时间不同 (2)MTT(2)MTT 比色法比色法 2、细胞毒活性测定 对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细对指示细胞具有破坏作用的细胞因子，若与细胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因胞共育将会导致细胞死亡。因此，待测细胞因子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以子作一系列稀释后加至指示细胞培养体系，以检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细检测培养细胞的死细胞数作为判断指标，死细胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀胞数量与细胞因子的活性呈正比。应用系列稀释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系释的细胞因子标准品，制作其活性与剂量关系的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的标准曲线，以此作为待测品活性的定量测定的基础。的基础。本法常用于本法常用于TNF等的测定等的测定 Wish、Hep2/c 人干扰素人干扰素 L929 小鼠干扰素小鼠干扰素 Ratec 大鼠干扰素大鼠干扰素 A549 MDBK 多种族的多种族的IFN-和和IFN-本法常用于本法常用于IFNIFN等的测定，等的测定，IFNIFN可诱导细胞产生抑制可诱导细胞产生抑制病毒病毒RNARNA和和DNADNA合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产合成的酶，保护细胞不受病毒感染，产生细胞病变效应（生细胞病变效应（CPECPE）。）。VSV、EMCV及及Sindbis virus等等 细胞病变效应细胞病变效应(CPE)、抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量抑制病毒蚀斑形成或抑制病毒的产量 3 3、抗病毒活性测定法、抗病毒活性测定法 常用于检测抗病毒活性的细胞株常用于检测抗病毒活性的细胞株 常用于攻击细胞的病毒常用于攻击细胞的病毒 检测抗病毒活性的方法检测抗病毒活性的方法 趋化性趋化性(chemotaxis)(chemotaxis)：诱导细胞向由诱导细胞向由趋化因子低浓度处向趋化因子低浓度处向趋化因子高浓度处作趋化因子高浓度处作定向移动的特性定向移动的特性,可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。可采用琼脂糖和微孔小室趋化试验。化学增活性化学增活性(chemokinesis)(chemokinesis)：细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性细胞因子增强细胞的随机运动能力的特性,可采用琼可采用琼脂糖小滴化学动力学试验检测。脂糖小滴化学动力学试验检测。趋化因子诱导细胞移动的方式趋化因子诱导细胞移动的方式 4 4、趋化活性测定法、趋化活性测定法 滤膜：计数受趋化细胞 趋化因子 细胞 趋化试验原理示意趋化试验原理示意 靶细胞的选择与培养靶细胞的选择与培养 1、对所测的细胞因子有特异的敏感性 2、易培养、保存、生物学特性稳定 3、有良好的生长状态 4、种属适配 各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-1 D10（M）增殖法 IL-2、IL-4 EL-4（M）增殖法 IL-4 A352（H）增殖抑制法 IL-2 CTLL（M）增殖法 IL-4 IL-3 KG-1（H）增殖法 TF-1（H）增殖法 GN-CSF、IL-5 IL-6、EPO IL-4 CTLL（M）增殖法 IL-2 IL-5 BCL-1（M）增殖法 IL-4 各类细胞因子检测的常用靶细胞各类细胞因子检测的常用靶细胞 细胞因子 实验系统 干扰因素 IL-6 B9（M）增殖法 IL-4、IL-11 BM60（H）增殖法 IL-7 Clone-IXN/2b（M）增殖法 IL-8 中性粒细胞（M、H）趋化法 GM-CSF TF-1（H）增殖法 IL-3、IL-5 IL-6、IL-5 TNF/L929（M、H）细胞毒法 IFN wish（H）病变保护法 IFN-、IFN-L929（M）病变保护法 IFN-、IFN-敏感性较高敏感性较高 特异性不高特异性不高 操作繁琐操作繁琐 易受干扰易受干扰 生物学活性测定方法学评价生物学活性测定方法学评价 （二）免疫学检测（二）免疫学检测 细胞因子(或受体)与相应的特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)结合，通过同位素、荧光或酶等标记技术加以放大和显示，从而定性或定量显示细胞因子(或受体)的水平。1、ELISA法 2、酶联免疫斑点实验 3、流式细胞分析法 1 1、ELISAELISA方法方法 ELISAELISA法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一法是应用最为广泛的非均相酶标免疫分析技术，一步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成步或多步的抗原抗体反应和一步酶促反应构成ELISAELISA的基的基本步骤，可作定性或定量分析。本步骤，可作定性或定量分析。ELISAELISA法不仅可以用于细法不仅可以用于细胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘胞因子检测，也可用于可溶性细胞因子受体或可溶性粘附因子的测定附因子的测定 敏感性偏低敏感性偏低 不能判断细胞因子的生物学活性。不能判断细胞因子的生物学活性。ELISAELISA 特异、简便特异、简便 易于推广和标准化等优点易于推广和标准化等优点 可同时检测大量标本且试验废弃物便于处可同时检测大量标本且试验废弃物便于处理理 细胞因子测定的首选方法细胞因子测定的首选方法 2 2、酶联免疫斑点试验、酶联免疫斑点试验(ELISPOT(ELISPOT或或ElisaSpot)ElisaSpot)在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，在包被有待测细胞因子抗体的微孔板上，加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有加入可分泌相应细胞因子的待测细胞，经在有或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌或无刺激物存在的条件下培养，待测细胞分泌细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕细胞因子于其周围，并被板上的特异性抗体捕获。后续的反应如同获。后续的反应如同ELISAELISA，即在洗去细胞后视，即在洗去细胞后视用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直用于试验的酶标抗体为一抗或二抗，分别作直接或间接法。接或间接法。一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑一个斑点代表一个细胞因子分泌细胞，斑点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子点的颜色深浅程度与细胞分泌的细胞因子量相关量相关 基基 本本 原原 理理 ELISPOT 3 3、流式细胞分析法、流式细胞分析法 流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪流式细胞分析法，是基于荧光抗体染色技术并借助流式细胞仪敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞敏感的分辨力所建立的方法。该法主要用于细胞内细胞因子和细胞表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速表面粘附分子的检测，通过特异性的荧光抗体染色，能简单、快速地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同地进行单个细胞水平的细胞因子或粘附因子的检测，精确判断不同细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。细胞亚群细胞因子和膜分子的表达情况。1 1分离和培养待检细胞分离和培养待检细胞 2 2细胞固定细胞固定 3 3封闭非特异性结合位封闭非特异性结合位点点 4 4染色与分析染色与分析 基本步骤基本步骤 细胞内细胞因子检测技术细胞内细胞因子检测技术 激活 膜抗原标记 细胞内细胞因子标记 使用流式细胞分析法，可以：使用流式细胞分析法，可以：区分不同分泌特性的细胞亚群：区分不同分泌特性的细胞亚群：Th1Th1细胞细胞 IFNIFN-Th2Th2细胞细胞 ILIL-4 4 细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：细胞表面的粘附分子或细胞因子受体：单克隆抗体技术单克隆抗体技术 直接或间接荧光抗体染色直接或间接荧光抗体染色 无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭无需作细胞固定和非特异性结合位点的封闭 待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好待测细胞是新鲜分离或培养的活细胞，保持良好状态状态 免疫学测定方法学评价免疫学测定方法学评价 优点：优点：特异性高特异性高 操作简便、快速，无需依赖细胞株操作简便、快速，无需依赖细胞株 影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。影响因素较少且易控制，重复性好，方法容易标准化。缺点：缺点：所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不所测定的只是细胞因子的蛋白含量，与其生物活性不一定呈正比一定呈正比 结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系结果与所用的抗体来源及亲和力有很大的关系 敏感性相对较低敏感性相对较低 标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对标本中细胞因子的可溶性受体，会影响特异性抗体对细胞因子的结合细胞因子的结合 （三）分子生物学检测（三）分子生物学检测 此方法测定的并非细胞因子本身，而是细此方法测定的并非细胞因子本身，而是细胞因子的基因。胞因子的基因。方法：方法：1、Northern印迹杂交法印迹杂交法 2、Southern 印迹杂交法印迹杂交法 3、PCR与逆转录与逆转录PCR 4、原位杂交，原位、原位杂