DB51T 2685-2020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法.pdf

ICS 65.020.30 B 41 DB51 四川省地方标准 DB51/T 26852020 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法 2020-07-14 发布 2020-08-01 实施四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 26852020 I 目 次 前言.II1 范围.12 规范性引用文件.13 缩略语.14 仪器.15 耗材.26 试剂.27 样品采集和处理.28 CPA 操作程序.39 样品处理及生物安全管控措施.4附录 A（规范性附录）溶液配制.6附录 B（规范性附录）引物.7附录 C（规范性附录）CPA 反应体系.8 DB51/T 26852020 II 前 言 本规范依据GB/T1.12009的规定起草。本标准由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本标准由四川省市场监督管理局批准。本标准起草单位：四川省动物疫病预防控制中心、四川纳比生物科技有限公司。本标准主要起草人：陈斌、周明忠、陈弟诗、袁旦一、李晓琪、裴超信、张毅、邓飞、李丽、邵靓、陈冬、蔡冬冬、丁梦蝶、邱明双、周莉媛、张睿、辜良斌。DB51/T 26852020 1 猪伪狂犬病毒交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒的交叉引物恒温扩增（CPA）检测方法。本标准适用于四川省行政区域范围内猪伪狂犬病毒核酸检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 251722010 猪常温精液生产与保存技术规范 SN/T 3567.12013 交叉引物恒温扩增检测方法 第1部分：通用技术规程 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。3.1 CPA 交叉引物恒温扩增（Crossing Primming Amplification）3.2 DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribomucleic acid）3.3 Bst 酶 Bst DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）3.4 TE 缓冲液 Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTA buffer）3.5 PRV 伪狂犬病毒（pseudorabies virus）3.6 PBS 磷酸盐缓冲液 4 仪器 DB51/T 26852020 2 4.1 恒温金属浴。4.2 高速台式冷冻离心机。4.3 组织研磨仪或研钵。4.4 普通冰箱：28。4.5 普通冰柜：-20以下。4.6 超低温冰箱：可控温至-70。4.7 微量移液器：0.2L2.5L、2L20L、20L200L、100L1000L，并配备与移液器匹配的吸头。4.8 高压灭菌锅。4.9 干烤灭菌器。4.10 普通 PCR 仪。5 耗材 5.1 1.5mL 离心管。5.2 0.2mLPCR 薄壁管或八连管。5.3 PCR 管漂浮板。6 试剂 6.1 除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。6.2 DNAzol 于 2-8保存；商品化 DNA 提取试剂按说明书要求条件保存。6.3 无水乙醇，-20预冷。6.4 75%乙醇，无水乙醇和双蒸水配制，-20预冷。6.5 8mmol/LNaOH 溶液，配制见附录 A。6.6 PBS 缓冲液，配制见附录 A。6.7 Bst 酶及 Bst 酶反应缓冲液：Bst 酶浓度为 8U/L，Bst 酶反应缓冲液为 10Thermopol*Buffer，Mg2+浓度为 100mmol/L。6.8 dNTP Mix：含 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 各 10mmol/L,-20保存，避免反复冻融。6.9 引物序列参见附录 B。6.10 伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，-20保存备用；阴性对照可采用 ddH2O。6.11 石蜡油，按说明书要求条件保存。7 样品采集和处理 7.1 采样工具 7.1.1 手术刀、剪刀、镊子，经 160干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。7.1.2 一次性无菌棉拭子。7.1.3 组织研磨器或者研钵，经 160干热灭菌 2h 或高压灭菌烘干。7.1.4 一次性注射器/真空采血管。7.2 样品采集 DB51/T 26852020 3 7.2.1 血液样品采集：用含有 EDTA 的真空采血管采集血液，充分混匀，编号备用。7.2.2 血清样品采集：不含有 EDTA 的真空采血管时，采血后静置析出血清，将血清转入离心管编号备用。7.2.3 精液样品采集：按照 GB/T 251722010 中第 4、8 章节的方法采集和保存精液。7.2.4 鼻拭子样品采集：用棉拭子取受检动物鼻腔分泌物，置于 2mlPBS 缓冲液中备用。7.2.5 组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组织 5-10g，置于无菌离心管内，编号备用。7.3 样品保存和运输 采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2-8下保存应不超过24h，-205下应不超过3个月，-70以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。7.4 样品处理 7.4.1 血液和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。7.4.2 鼻拭子样品：充分震荡洗脱含有鼻拭子的管子 1min 左右，弃去拭子后静置 5min，取上清用于后续的核酸提取。7.4.3 组织样品：取 2g 左右的组织，剪碎，加入 1-2mlPBS 缓冲液进行研磨至匀浆状态，8000r/min，离心 1min 取上清用于后续的核酸提取。8 CPA 操作程序 8.1 DNA 提取试剂 8.1.1 核酸提取区进行操作。DNA 提取使用 DNAzol 手工提取，也可以使用商品化试剂盒提取。8.1.2 取 n 个灭菌的 1.5ml 离心管，其中 n 为待检样品数量加上阴阳性对照，对每个离心管进行编号。8.1.3 每管先加入 800LDNAzol，再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 L，颠倒 10 次混匀，4或室温 10000 r/min 离心 10min。8.1.4 取 900L 上清，置于新的 1.5ml 离心管中，加入 500 L 无水乙醇，混匀，室温放置 3min；4或室温 10000 r/min 离心 5min。8.1.5 弃上清，沿管壁缓缓加入 0.8mL-1 mL 乙醇，颠倒 3-6 次混匀，4 10000 r/min离心 5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干或用移液器移去残液。8.1.6 用 30L 8mmol/L NaOH 溶液溶解沉淀，DNA 在 2-8冰箱可保存两个月，-20冰柜可保存 2年左右。8.2 CPA 反应 8.2.1 反应体系的配制 在试剂准备区进行。设CPA反应管为n,n为待检样品数量加上阴阳性对照，每个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n+1反应进行配制。8.2.2 反应液的分装 将8.2.1中配制的CPA反应液充分混匀，按照每管16 L分装于0.2mL透明PCR管内，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。DB51/T 26852020 4 8.2.3 加样 在核酸提取区进行。在每个PCR反应管中分别加入8.1制备的DNA核酸溶液4L，再向每管滴加20L石蜡油，盖上盖子，将反应管以大于4000 r/min瞬时离心3-5秒。转移至检测区。8.2.4 CPA 扩增 方法一：将PCR反应管置恒温设备（水浴锅、金属浴）上，63避光温浴35min。方法一：实验室若暂时无石蜡油，可将PCR管置于普通PCR仪，程序设置热盖105，样品孔63，35min。8.2.5 结果判定 8.2.5.1 操作程序 将恒温扩增后的PCR反应管（不可开盖，以避免污染）放入一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）（按照SN/T 3567.12013中附录B操作），检查液泡有无漏液以及是否在下图（图1）所示位置，合上核酸检测装置内芯后将其装入装置外盒。图1 操作示意图 注1：按手柄至检测装置于关闭状态，将检测装置放置在操作台上，同时开始计时。15min-30min内通过阅读窗判读结果并记录结果，30min后判读结果无效。8.2.5.2 结果描述及判定 试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区（C线），一条位于检测区（T线），结果判定为阳性。试纸条质控区（C线）出现一条红色条带，检测区（T线）没有条带，结果判定为阴性。试纸条质控区（C线）和检测区（T线）均未出现条带，或仅检测区（T线）出现红色条带，检测结果无效。表明试纸条已损坏、失效或者操作有误。此时应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。（图2）图2 检测结果判读示意图 9 样品处理及生物安全管控措施 DB51/T 26852020 5 实验完毕后，立即对实验室检测环境进行消毒，同时对样品及试验过程中产生的废弃物进行高温高压灭菌处理，并送有资质的无害化处理公司进行处理。DB51/T 26852020 6 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制 A.1 8mmol/L NaOH溶液 称量0.32g NaOH，溶解到1000 mL去离子水中，混匀，分装，常温保存。A.2 磷酸盐缓冲液（0.01mol/L PBS，pH7.4）用800mL蒸馏水溶解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。用HCl调节溶液的pH至7.4，加水至1L。分装后经121、15min高压灭菌后备用。DB51/T 26852020 7 B B 附 录 B（规范性附录）引物 表B.1 引物的名称与序列 名称 序列 PRVgE p1 5-ACGAGCCCCGCTTCCA-3 PRVgE p2 5-CATGTCCGAGACCACGCGCGTCCACTCGCAGCTCTTCT-3 PRVgE p3 5-FAM-GCATCAGGTCGAACGTGT-3 PRVgE p4 5-Biotion-CATGTCCGAGACCACGCGCG-3 PRVgE p5 5-CCAGCGTGGCGGTAAAGTTCTC-3 PRVgE p6 5-CGCGGGTGGTAGATGCA-3 注：引物和探针可由生物公司合成，用TE溶液溶解并稀释至100mol/L储存浓度，-20保存备用，保存期为1年；根据需要配制成40mol/L工作浓度，-20保存供检测使用，如经常使用反复冻融，有效期为3个月。DB51/T 26852020 8 C C 附 录 C（规范性附录）CPA 反应体系 C.1 CPA反应体系 组分组分 1 个检测反应的加入量个检测反应的加入量 10Thermopol*Buffer 2 L Bst 酶（8U/L）1 L dNTP（10 mmol/L）0.8 L Mg2+（100 mmol/L）0.6 L PRVgE p1（40mol/L）0.1 L PRVgE p2（40mol/L）0.25 L PRVgE p3（40mol/L）0.25 L PRVgE p4（40mol/L）0.25 L PRVgE p5（40mol/L）0.25 L PRVgE p6（40mol/L）0.1 L ddH2O 10.4 L 合计 16 L _