DB22T 2922-2018 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光RT-PCR法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 29222018 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光 RT-PCR 法 Detection of chicken infectious bronchitis virus Real-time PCR method 2018-11-12 发布 2018-12-30 实施吉林省市场监督管理厅 发 布 DB22/T 29222018 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：呼延含蓉、程荣华、柴方红、张淑莹、王楠、于钦磊、高春生、吴丹、孙亮、马晓媛、卢松岩、付瑶、王建超、陆伟、何浩、傅国群。DB22/T 29222018 1 鸡传染性支气管炎病毒检测 荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法的材料、操作步骤和结果判定。本标准适用于鸡传染性支气管炎的诊断、监测及流行病学调查。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 材料 3.1 仪器设备 3.1.1 干热灭菌箱。3.1.2 高压蒸汽灭菌器。160 。3.1.3 冰箱，2 8，-20 和-80 三种。3.1.4 恒温水浴锅，控温范围为室温至 100。3.1.5 可调移液器，最大量程为 10 L，200 L，1000 L。3.1.6 高速冷冻离心机，12 000r/min 以上。3.1.7 荧光定量 PCR 扩增仪。3.2 器械与耗材 3.2.1 医用棉签。3.2.2 医用剪刀，16 cm。3.2.3 医用镊子，16 cm。3.2.4 1.5 mL 离心管，15 mL 离心管，50 mL 离心管。3.2.5 组织匀浆器或研钵。3.2.6 吸头，10 L，20 0L，1000 L。3.2.7 荧光 PCR 管。3.3 试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的要求。3.3.1 0.02 mmol/L PBS，见附录 A。3.3.2 RNA 提取试剂盒。3.3.3 荧光 RT-PCR 反应液。3.3.4 灭菌双蒸水。DB22/T 29222018 2 3.3.5 阳性对照，鸡传染性支气管炎病毒 S1 基因序列片段，见附录 B。3.4 引物和探针 3.4.1 引物和探针序列见表 1。表1 引物和探针序列 名称 序列 上游引物 F 5-ATC CTT TTA TTA ATA GTA-3 下游引物 R 5-TAG TTT CTA GTC TAA AAT TAC-3 探针 P 5-CAA ACA CAA ACA GCT CAG AGT-3 3.4.2 引物和探针均用灭菌双蒸水稀释成 10 mol/L，-20 保存备用。4 操作步骤 4.1 采样器具前处理 4.1.1 组织匀浆器或研钵（3.2.5）、医用剪刀（3.2.2）、镊子（3.2.3）经 160 干热（3.1.1）灭菌 2 h。4.1.2 1.5 mL 离心管（3.2.4）经 121 2 高压蒸汽（3.1.2）灭菌 15 min。4.2 样品的采集、贮运和保存 4.2.1 棉拭子样品的采集 将医用棉签（3.2.1）深入喉头上腭及上腭裂来回刮 3 次 5 次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将咽喉拭子放入盛有 1.0 mL PBS（3.3.1）的离心管中，编号备用。4.2.2 组织样品的采集 采集鸡气管的下 1/3 段和肺脏，置于无菌离心管（15 mL 或 50 mL）。4.2.3 样品的贮运 样品采集后应置于加冰袋的保温箱中、密封，24 h 内送至实验室进行处理，超过 24 h 应冷冻保存。4.3 样品的处理 4.3.1 棉拭子的处理 将装有棉拭子的离心管反复震荡离心，3000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。4.3.2 组织样品的处理 将组织样品按 1:10 比例加入PBS，用组织匀浆器或研钵研磨匀浆，3000 r/min 离心 15 min，取上清液待检。4.4 RNA 提取 DB22/T 29222018 3 按照 RNA 提取试剂盒（3.3.2）说明书要求操作提取待检样品的 RNA，提取的RNA应迅速进行荧光定量 RT-PCR 扩增。若需长期保存应放置-80 冰箱。4.5 反应体系 4.5.1 荧光 RT-PCR 扩增反应体系见表 2。表2 荧光 RT-PCR 反应体系 试剂 剂量 上游引物 F(10 mol/L)0.8 L 下游引物 R(10 mol/L)0.8 L 探针 P(10 mol/L)0.5 L 荧光RT-PCR反应液 10 L 灭菌双蒸水 5.9 L 待检样品 RNA 2.0 L 总体积 20.0 L 4.5.2 以灭菌双蒸水为阴性对照，以鸡传染性支气管炎病毒 S1 基因序列片段为阳性对照（3.3.5）。4.6 反应程序 4.6.1 荧光 RT-PCR 反应程序见表 3。表3 荧光 RT-PCR 反应程序 反应步骤 温度 时间 循环数次 第一步 42 30 min 1 第二步 95 2 min 1 95 15 s 第三步 60（在此收集荧光）1 min 40 4.6.2 将 PCR 反应管置荧光 PCR 仪（3.1.7）扩增，选择 FAM 通道。5 结果判定 5.1 结果分析条件设定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果。5.2 质控标准 5.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无典型扩增曲线。5.2.2 阳性对照的 Ct 值应35.0，并出现特定的扩增曲线。5.2.3 如阴性对照和阳性对照不满足以上所有条件，检测结果视为无效。DB22/T 29222018 4 5.3 结果描述及判定 5.3.1 无 Ct 值，无典型的扩增曲线或反应曲线无明显对数增长期，判为鸡传染性支气管炎病毒核酸阴性。5.3.2 Ct 值 35.0，出现典型的扩增曲线，判为鸡传染性支气管炎病毒核酸阳性。5.3.3 35.0 Ct 值 40.0，出现特定的扩增曲线，样品判为疑似。应重新采样检测，结果仍为疑似，判定为鸡传染性支气管炎病毒核酸阳性。DB22/T 29222018 5 A A 附 录 A（规范性附录）磷酸盐缓冲生理盐水 A.1 A液 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液，称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.2 B液 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液，称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.3 0.02mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 量取 0.2 mol/L的A液 360 mL，0.2 mo1/L 的B液140mL，称取氯化钠 38 g，用去离子水溶解稀释至 5000 mL，4 保存。DB22/T 29222018 6 B B 附 录 B（规范性附录）S1 基因序列片段 S1基因序列片段。tccttttattaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc aaccctaatc ctagtggtgt tcagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt atgtatggat cttatcaccc aagttgtaat tttagactag aaact _