DB22T 2010-2014 家畜(猪牛羊)戊型肝炎病毒的测定RT-PCR法.pdf

ICS 11.220 B 41 备案号：41804-2014 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 20102014 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR 法 Detection of Hepatitis E virus by RT-PCR in Livestock（pig/cattle/sheep）2014-02-28 发布 2014-04-30 实施吉林省质量技术监督局 发 布 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 1 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：吉林省畜牧兽医科学研究院。本标准主要起草人：苏双、邵洪泽、许志林、程荣华、王楠、李琳、毛文智、王忠国、李文东，于丹。本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 2 家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒的测定 RT-PCR 法 警告使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。1 范围 本标准规定了家畜（猪牛羊）戊型肝炎病毒RT-PCR测定方法。本标准适用于猪、牛、羊等家畜戊型肝炎病毒的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 戊型肝炎病毒 Hepatitis E virus HEV 戊型肝炎病毒科成员。一种单股正链RNA病毒，呈球形、直径2734 nm，无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。病毒基因组长约7.2 knt，有3个开放阅读框（ORF1、ORF2、ORF3）。ORF2位于3端，为主要的结构基因编码区，可编码核衣壳蛋白。3.2 聚合酶链反应 polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反应（PCR）技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性复性延伸三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。3.3 反转录 reverse transcription RT 反转录（RT）是以RNA为模板合成互补DNA（cDNA）的过程。4 试剂与材料 4.1 引物 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 3 引物序列见表1，引物浓度为25 mmol/L。表1 特异性引物序列 引物种类 引物名称 特异性引物的核苷酸序列 扩增片段长度（bp）外引物 HEV-1 5-TAY CGH AAY CAA GGH TGG CG-3（第 1 次 PCR 引物）HEV-2 5-TGY TGG TTR TCR TAR TCC TG-3 524 内引物 HEV-3 5-ATW CAT GGV TCR CCT GTG AA-3（第 2 次 PCR 引物）HEV-4 5-AAA TYA ATT CTG TCG GRA GC-3 328 注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/C/T，V=A/C/G。4.2 试剂 4.2.1 RNA 提取试剂盒 4.2.2 RT-PCR 试剂盒 4.2.3 DNA 分子质量标准（DNA Marker）DNA分子质量标准可采用100 bp DNA ladder Maker、DNA Marker DL 2 000或其它等效产品。4.2.4 其它试剂 4.2.4.1 双蒸水：符合 GB/T 6682 中 4.2 二级水要求；4.2.4.2 0.1%DEPC 水：见附录 A 中 A.1；4.2.4.3 75%无水乙醇：见附录 A 中 A.2；4.2.4.4 10 mg/mL 溴化乙锭（EB）或其替代品：见附录 A 中 A.3；4.2.4.5 凝胶加样缓冲液：见附录 A 中 A.4；4.2.4.6 1 倍 Tris-硼酸电泳缓冲液：见附录 A 中 A.5；4.2.4.7 灭菌 1 mol/L 磷酸缓冲盐溶液（PBS）：见附录 A 中 A.6。4.3 材料 4.3.1 一次性无菌手套或乳胶手套；4.3.2 1.5 mL 离心管；4.3.3 0.2 mL PCR 反应管；4.3.4 琼脂糖；4.3.5 500 mL 量筒；4.3.6 500 mL 锥形瓶；4.3.7 吸头；4.3.8 眼科剪；4.3.9 眼科镊；4.3.10 称量纸。5 仪器设备 5.1 PCR 仪；5.2 电泳仪；本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 4 5.3 电泳槽；5.4 紫外光透射仪或凝胶成像系统；5.5 高速台式冷冻离心机：12 000 r/min；5.6 微型高速离心机：12 000 r/min；5.7 水浴锅：30-100；5.8 分析天平：感量 0.1 g；5.9 微波炉；5.10-20冰箱；5.11 旋涡振荡器；5.12 乳钵或玻璃研磨器；5.13 微量移液器。6 样品的采集及处理 6.1 肝脏样品的采集及处理 采取肝脏样品约1.0 g 2.0 g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1 mol/L PBS 溶液配成15乳悬液，反复冻融3次。4 8 000 r/min离心5 min，收集上清液，供RNA抽提或者-20 保存备用。6.2 粪便样品的采集及处理 挑取0.5 g1.0 g粪便样品于1.5 mL离心管内，加入灭菌的1 mol/L PBS 溶液，旋涡震荡混匀，制备成10%的粪便悬液，4 8 000 r/min离心10 min，收集上清液，供RNA抽提或者-20 保存备用。6.3 阳性及阴性对照 6.3.1 阳性对照 用 HEV NNA-1株等参考株作为阳性对照样品。6.3.2 阴性对照 用0.1%DEPC 水代替RNA作为阴性对照。6.4 待检样品 RNA 提取 取上述处理好的样品100 L于1.5 mL无RNA酶离心管中，每管加入1 000 L Trizol试剂，混匀，室温放置5 min；加入200 L氯仿，混匀，室温放置5 min，4，12 000 r/min离心10 min。取上清400 L于一个新的无RNA酶离心管，加入40 LRNA助沉剂，加入440 L异丙醇，混匀，-20放置30 min，4，12 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀用0.1%DEPC 水配置的75%乙醇洗涤两次，在生物安全柜中通风晾干，加入25 L 0.1%DEPC水溶解沉淀，获得的RNA样品可直接进行反转录（RT）或置-20 以下保存，尽快使用。本操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条件下进行。7 RT-PCR 测定 7.1 RT 反应 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 5 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分：a)待检样品 RNA：10 L；b)10 mmol/L dNTPs 混合物：2 L，终浓度为 0.8 mmol/L；c)25 mmol/L HEV 外下游引物（HEV-2）：1 L，终浓度为 1.0 mmol/L。加完试剂后瞬时离心混匀。72 5min，冰浴 2min。取出后再依次加入下列试剂：d)5RT 缓冲液（RT Buffer）：5 L，终浓度为 1 倍；e)200 U/L M-MuLV 反转录酶：1 L，终浓度为 8 U/L；f)40 U/L RNA 酶抑制剂：1 L，终浓度为 1.6 U/L；g)0.1%DEPC 水：5L。反应总体积为25 L。加完试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下程序进行RT反应：42 反应1h；然后95 灭活反转录酶5 min。RT反应获得的cDNA 可直接进行PCR反应或置-20 保存备用。本加样操作应在一个无RNA酶（Rnase）的条件下进行。7.2 外引物 PCR 扩增 7.2.1 扩增体系 在冰浴条件下，按下列试剂用量在PCR反应管中分别加入各成份：a)灭菌双蒸水：15.7 L；b)10PCR 缓冲液（PCR Buffer）：2.5 L，终浓度为 1 倍；c)20 mmol/L MgCl2：2.0 L，终浓度为 1.6 mmol/L；d)10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 L，终浓度为 0.2 mmol/L；e)25 mmol/L HEV 外引物（HEV-1/HEV-2）：各 0.5 L，终浓度为 0.5 mmol/L；f)5 u/L Taq DNA 聚合酶：0.3 L，终浓度为 0.06 u/L；g)RT 反应产物（cDNA）：3 L。7.2.2 扩增条件 依次加入试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下反应程序进行PCR反应：94 预变性4 min；然后进入94 变性40 s，53 复性40 s，72 延伸60 s的循环，共进行35个循环；72 彻底延伸10 min；4 保存。PCR产物用于下一轮内引物PCR反应。7.3 内引物 PCR 扩增 7.3.1 扩增体系 在冰浴条件下，按下列试剂用量在 PCR 反应管中分别加入各成分：a)灭菌双蒸水：15.7 L；b)10PCR 缓冲液（PCR Buffer）：2.5 L，终浓度为 1 倍；c)20 mmol/L MgCl2：2.0 L，终浓度为 1.6 mmol/L；d)10 mmol/L dNTPs 混合物：0.5 L，终浓度为 0.2 mmol/L；e)25 mmol/L HEV 内引物（HEV-3/HEV-4）：各 0.5 L，终浓度为 0.5 mmol/L；f)5 u/L Taq DNA 聚合酶：0.3 L，终浓度为 0.06 u/L；g)第一次 PCR 产物：3 L。7.3.2 扩增条件 本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印本标准仅供内部使用 不得翻印DB22/T 20102014 6 依次加入试剂后瞬时离心混匀。将PCR反应管置于PCR仪内，按如下反应程序进行PCR反应：94 预变性4 min；然后进入94 变性50 s，53 复性50 s，72 延伸50 s的循环，共进行35个循环；72 彻底延伸10 min；4 保存。PCR 产物可直接进行琼脂糖凝胶电泳分析或置4 保存备用。7.4 电泳 7.4.1 1%琼脂糖凝胶的制备及放置 将凝胶托架水平放置在工作台上，并放上梳子。称取1.0 g琼脂糖于三角烧瓶中，加入100 mL 1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，用微波炉加热溶解琼脂糖；待琼脂糖溶液冷却至约50 时，加入10 mg/mL溴化乙锭（EB）溶液5 L，使其终浓度为0.5 g/mL，充分混合，避免起气泡，倒入凝胶托架，凝胶厚度控制在35 mm之间；待凝胶完全凝固后轻轻拔出梳子。将凝胶连同托架一起放入电泳槽中，加入1倍Tris-硼酸电泳缓冲液，使之浸过凝胶表面约2 mm。7.4.2 加样 将5 L PCR 产物与1 L 凝胶加样缓冲液混合均匀，加至琼脂糖凝胶加样孔中。同时在琼脂糖凝胶板一侧加样孔中加入DNA分子质量标准物。7.4.3 电泳条件 以5 V/cm凝胶长的稳压电泳，电泳30 min，停止电泳。8 结果判定 8.1 将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外光透射仪或凝胶成像系统上观察，与 DNA 分子质