DB53/T877—2018甘蔗锈病病原菌分子检测技术规程2018-07-01发布2018-10-01实施ICS65.020B15中华人民共和国国家市场监督管理总局备案号：59625-2018云南省地方标准云南省质量技术监督局发布DB53/T877—2018I前言本标准按照GB/T1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本标准由云南省农业标准化技术委员会(YNTC07)归口。本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本标准主要起草人：王晓燕、李文凤、黄应昆、张荣跃、单红丽、仓晓燕、罗志明、尹炯。DB53/T877—20181甘蔗锈病病原菌分子检测技术规程1范围本标准规定了甘蔗锈病病原菌PCR检测方法的样品采集、设备和器具、试剂、对照设置、操作程序以及结果判定等。本标准适用于甘蔗锈病病原菌的分子检测。2术语与定义下列术语和定义适用于本文件。2.1甘蔗锈病是指由黑顶柄锈菌PucciniamelanocephalaH.Sydow&P.Sydow引起甘蔗褐锈病症状的真菌病害，和由屈恩柄锈菌Puccinakuehnii(Kruger)Butler引起甘蔗橙锈病的真菌病害。甘蔗锈病症状及其病原菌形态特征参见附录A。3样品采集3.1采集时间于8月～10月采集疑似甘蔗褐锈病和甘蔗橙锈病的病叶。3.2采集部位甘蔗叶片组织。3.3采集方法宜戴一次性手套采集，且每采一个样品换一次手套，过程中应避免样品交叉污染。3.4样品保存样品放入密封袋中，于-20℃保存备用。DB53/T877—201824PCR检测4.1设备和器具4.1.1设备设备包括PCR扩增仪、凝胶成像仪、台式离心机、涡旋混匀器、恒温水浴锅、电泳仪、电子天平（感量0.01g～0.0001g）、电泳槽、微波炉、-20℃冰箱、可调微量移液器等。4.1.2器具移液枪头、离心管、PCR管等。4.1.3器具灭菌所有器具使用前需经高压蒸汽121℃灭菌30min。4.2试剂4.2.1基本要求所用试剂均为分析纯，水为灭菌去离子水。4.2.2PCR试剂PCR试剂包括：a)2×EasyTaqPCRSuperMix（含染料）。b)检测黑顶柄锈菌引物（上游引物PM-F：5’-AATTGTGGCTCGAACCATCTTC-3’、下游引物PM-R：5’-TTGCTACTTTCCTTGATGCTC-3’）。c)检测屈恩柄锈菌引物（上游引物PK-F：5’-AAGAGTGCACTTAATTGTGGCTC-3’、下游引物PK-R：5’-CAGGTAACACCTTCCTTGATGTG-3’）。4.2.3TBE电泳缓冲液4.2.3.110×TBE存储液取108gTris、55g硼酸和7.44gNa2EDTA·2H2O，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，定容至1000mL，室温保存。4.2.3.20.5×TBE工作液用去离子水将存储液稀释20倍，即为工作液。4.2.4扩增产物检测...
