DB51T 2913-2022 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程.pdf

ICS 65.150 CCS B 52 DB51 四川省地方标准 DB51/T 29132022 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程 Specification for diagnosis and control of Pathogen Nocardiosis from Micropterus salmoides 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 29132022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂和材料.1 5 设备和仪器.2 6 临床检查.2 7 实验室样品采集.2 8 细菌的分离与培养.2 9 细菌的鉴定.2 10 结果判定.4 11 综合判定.5 12 防治方法.5 附录 A（规范性）培养基和试剂配制方法.6 附录 B（资料性）16S rDNA 基因参考序列（GeneBank 登录号：JCM3360）.7 DB51/T 29132022 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：成都农业科技职业学院、四川农业大学、内江师范学院。本文件主要起草人：李成伟、耿毅、王均、贺扬、吴宏伟、刘海燕、王振华、李建臻、黎丽。本文件首次发布。DB51/T 29132022 1 大口黑鲈诺卡氏菌病诊断和防治技术规程 1 范围 本文件规定了大口黑鲈（Micropterus salmoides）养殖过程中发生的诺卡氏菌病的流行情况、发病症状、诺卡氏菌的分离培养、形态学鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA基因鉴定、特异性鉴定及其防治等技术规程。本文件适用于大口黑鲈诺卡氏菌病的诊断和防治。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926.43 实验动物 细菌学检测 染色法、培养基和试剂 GB/T 27623.1 渔用抗菌药物药效试验技术规范 NY 5051 无公害食品 淡水养殖用水水质标准 SC/T 1132 渔药使用规范 SC/T 7014 水生动物检疫实验室技术规范 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 DB51/T 526 大口黑鲈养殖技术规范 食用鱼 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 大口黑鲈诺卡氏菌病 nocardiosis of largemouth bass 指由鰤诺卡氏菌（Nocardia seriolae）感染大口黑鲈引起的一种细菌性传染病。4 试剂和材料 水 4.1 用水符合GB/T 6682-2008中一级水规格。试剂与培养基 4.2 革兰氏染液配制按照GB/T 14926.43中的规定执行，牛脑心浸液培养基（BHI）、50TAE缓冲液、1%琼脂糖凝胶、七叶苷培养基、明胶培养基等相关配方见附录A，细菌基因组DNA提取试剂盒、PCR纯化试剂盒选用专业试剂公司提供的商品化试剂盒。DB51/T 29132022 2 16S rRNA 扩增引物 4.3 16S rRNA 基 因 序 列 扩 增 引 物，27F：5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ，1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3。特异性鉴定引物 4.4 特异性鉴定上游引物 N5F1：5-TGAGCCTGAACTGCATGGTTC-3，下游引物 N5R1：5-ACGGTATCGCAGCCCTCTGTA-3。5 设备和仪器 超净工作台、光学显微镜、PCR仪、电泳仪、离心机、生化培养箱、恒温摇床培养箱、常规细菌接种器械（包括培养皿、酒精灯、接种环、酒精棉等）、4/-20冰箱等。6 临床检查 流行情况 6.1 水温1532时都可流行，我省在每年4月底开始大规模爆发，直至10月均有该病流行，2528为发病高峰期，死亡率高。临床和解剖症状 6.2 患病鱼反应迟钝、离群独游，食欲下降，主要病变为体表出现溃疡灶以及出血点，在鳃丝、躯干皮下脂肪、肌肉、腹腔（包括肝、肾、脾、鱼鳔、肠系膜）出现乳白色或黄色结节，结节大小通常直径 0.53mm，肝脏肿大、淤血，鱼鳔腔内有积液等。7 实验室样品采集 样品采集按SC/T 7013中的规定执行。8 细菌的分离与培养 用75%酒精棉球对样品体表进行擦拭消毒后，无菌操作取肝脏、头肾、中肾和脾脏进行病原菌分离。利用接种环，划线接种至BHI固体培养基，28恒温培养箱培养712d，从形态一致的优势菌群中挑取单个菌落进一步纯化培养。9 细菌的鉴定 形态学鉴定 9.1 9.1.1 菌落形态 分离病原菌在BHI固体培养基28培养712d后观察菌落形态。9.1.2 细菌形态 DB51/T 29132022 3 革兰氏染色法染色观察，参照GB/T 14926.43中的规定执行。生化特性鉴定 9.2 9.2.1 氧化酶试验 按SC/T 7014中的规定执行，菌落呈玫瑰红色，然后变为深紫色者为阳性。9.2.2 尿素酶试验 按SC/T 7014中的规定执行，红色为阳性。9.2.3 硝酸盐还原试验 按SC/T 7014中的规定执行，红色为阳性。9.2.4 过氧化氢酶试验 挑取单个菌落，置于洁净的载玻片上，加入3%过氧化氢12滴，观察有无气泡产生，有气泡产生者为阳性。9.2.5 柠檬酸盐试验 按SC/T 7014中的规定执行，培养基蓝色为阳性。9.2.6 七叶苷水解试验 将待检菌接种于七叶苷培养基，28培养712d，培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。9.2.7 明胶液化试验 将待检菌种接种于明胶培养基，28培养712d，明胶液化者为阳性。9.2.8 淀粉水解试验 按SC/T 7014中的规定执行，呈蓝色者为阴性，无蓝色者为阳性。16S rRNA 鉴定 9.3 9.3.1 总 DNA 提取 DNA提取采用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒，按说明书操作。9.3.2 16S rRNA 基因序列扩增 将上述提取DNA作为模板，利用“4.3”中的引物扩增16S rRNA序列，反应在25L体系中进行：PCR Premix 12.5L，上下游引物各1.0L，2.0L模板DNA，双蒸水补足至25L。反应条件：95预变性5min；95变性30s，55退火30s，72延伸1.5min，循环扩增30次；72终延伸10min。4保存备用。空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用1TAE电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶（含0.5L/mLEB）平板，凝固后放入水平电泳槽，使泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述扩增产物6L样品加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120VDB51/T 29132022 4 电泳约1530min，当指示剂到达底部时停止。于紫外光下观察电泳条带，在长波紫外灯下用刀片切下含有目的条带（约1500bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。9.3.4 PCR 扩增产物纯化 将上述琼脂糖凝胶电泳产物，使用PCR纯化试剂盒进行纯化DNA，按说明书操作。9.3.5 测序与同源性分析 将上述提取的DNA进行测序，并与参考序列（附录B）进行比对分析。特异性检测 9.4 9.4.1 特异性基因扩增 将“9.3.1”中提取DNA作为模板，利用“4.4”中的引物扩增，进行特异性PCR检测，同时设置阳性和阴性对照。反应在25L体系中进行，反应条件：94预变性4min；94变性1min，58退火30s，72延伸1.5min，循环扩增30次；72终延伸10min。9.4.2 序列检测 PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察片段大小。10 结果判定 菌落形态 10.1 沙粒状淡黄色菌落，粗糙易碎，边缘不整齐，在表面形成褶皱。细菌形态 10.2 革兰氏染色呈阳性，镜检可见菌体紫色分枝状。生理生化特性 10.3 生理生化反应试验结果见表1。表1 诺卡氏菌生理生化特性 检测项目 参照结果 检测项目 参照结果 七叶苷水解+过氧化氢酶+明胶液化-氧化酶-淀粉水解-脲素酶-硝酸盐还原-柠檬酸盐+注：“+”表示阳性，“-”表示阴性 16S rRNA 基因序列检测 10.4 预计扩增片段为1500bp，测定的16S rRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达98%以上。DB51/T 29132022 5 特异性检测 10.5 预计扩增片段为1069 bp。PCR产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，在1000bp条带处得到预期大小的单一明亮条带，同时阳性对照条带明亮，阴性对照无条带，判定为阳性。11 综合判定 符合以下a）b）c）三条特征的基础上，d）或者e）特征出现任意一条者判定为大口黑鲈诺卡氏菌病。a)患病大口黑鲈流行情况和发病症状与“6.1”和“6.2”相符；b)所分离病原菌菌落与菌体形态分别与“10.1”和“10.2”相符；c)生理生化反应结果与“表 1”相符；d)16S rRNA 基因序列与附录 B 所列的基因序列同源性分析结果达 98%以上；e)分离菌株 DNA 特异性基因检测阳性。12 防治方法 预防方法 12.1 放苗前做好清塘工作，使用无诺卡氏菌污染的水源和水系统，养殖用水符合NY 5051中的规定；购入的大口黑鲈苗种经检验检疫合格，不含诺卡氏菌病原；做好投饲及日常管理工作，参照DB51/T 526中的规定执行；在该病高发期，可选用聚维酮碘或戊二醛溶液等渔用消毒药物全池泼洒预防，按照商品说明使用。治疗方法 12.2 参照GB/T 27623.1中的规定筛选敏感抗生素药物，使用敏感抗生素和维生素C进行拌料内服，外用聚维酮碘或戊二醛溶液等渔用消毒药物全池泼洒，药物使用应符合SC/T 1132的要求。DB51/T 29132022 6 A A 附录A （规范性）培养基和试剂配制方法 A.1 BHI 牛脑心浸液固体培养基 在800ml双蒸水中加入37g BHI牛脑心浸液，1520g琼脂粉，混匀，加热搅拌溶解，调节pH值为7.40.2，定容至1000ml，121高压灭菌15min。A.2 50TAE 缓冲液 在400mL双蒸水中溶解121g Tris碱，加入28.55mL冰乙酸和50mL 0.5mol/L EDTA。再加双蒸水定容至500mL，室温保存。使用时，配成1TAE电泳缓冲液。A.3 1%琼脂糖凝胶 琼脂糖1g中加入1xTAE缓冲液100mL，加热溶解后，加入5L Goldenview混匀。A.4 七叶苷培养基 胰蛋白胨5.0g，磷酸二氢钾1.0g，七叶苷3.0g，柠檬酸铁铵0.5g，混匀，加热搅拌溶解，调节pH值为7.40.2，定容至1000ml，121高压灭菌15min。A.5 明胶培养基 NaCI 5g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，明胶120g，混匀，加热搅拌溶解，调节pH值为7.40.2，定容至1000ml，121高压灭菌15min。DB51/T 29132022 7 B B 附录B （资料性）16S rDNA 基因参考序列（GeneBank 登录号：JCM3360）1 ttaacacatg caagtcgagc ggtaaggccc ttcggggtac acgagcggcg aacgggtgag 61 taacacgtgg gtgatctgcc ttgcactctg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc 121 ggatatgagc ctgaactgca tggttcgggt tggaaagatt tatcggtgcg agatgggccc 181 gcggcctatc agcttgttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc 241 tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc agact