DB21T 3256-2020 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 32562020 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 Loop-mediated Isothermal Amplification（LAMP）for Rapid Detection for African Swine Fever Virus 2020-04-30 发布 2020-05-30 实施 辽宁省市场监督管理局发 布DB21/32562020 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本标准起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中国科学院微生物研究所、洛阳莱普生信息科技有限公司、辽宁佰瑞生物科技有限公司。本标准主要起草人：杨作丰、周晨阳、李秀梅、王宏燕、杨利敏、董娜、刘文军、张皓淳、姚伟、刘洋、刘近、吴洪涛、任雪建、赵培、李蓉、章春燕、吕园园、陈腾。本标准发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862；标准起草单位通讯地址：辽宁省动物及产品检疫中心（沈阳市沈河区万柳塘路105号甲），联系电话：024-24229579。DB21/T 32562020 1 非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法 1 范围 本标准规定了非洲猪瘟病毒等温扩增快速检测方法的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟疫病的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏等组织样品中非洲猪瘟病毒核酸的快速检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 原理 非洲猪瘟病毒是一种DNA病毒，该检测方法利用6条特异性引物和具有链置换能力的DNA聚合酶，在等温环境下1 h内完成扩增，用于非洲猪瘟病毒的核酸检测。4 仪器和器材 4.1 高速台式冷冻离心机（离心范围 020000 r/min）4.2 冰箱：4 1 冰箱，-20 1 冰箱，-7 1 冰箱 4.3 恒温 LAMP 扩增仪（型号：Gene-8C）4.4 离心管：15 ml 离心管、1.5 ml 离心管和 0.2 ml PCR 专用离心管 4.5 微量移液器：1000 l，200 l，100 l，50 l，20 l，10 l，2 l 5 试剂和引物 5.1 样品处理剂 5.2 ASFV-R-Mix 5.3 Bst enzyme 5.4 D-I 矿物油 5.5 阳性对照 5.6 阴性对照 注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所有实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。DB21/T 32562020 2 6 操作步骤 6.1 样品的采集、前处理、存放与运输 6.1.1 采样注意事项 采集样品及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。6.1.2 采样工具 15 ml离心管和1.5 ml离心管经1211 高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 干热灭菌2 h，无菌管（真空采血管）。6.1.3 组织病料的采集与前处理 采集疑似非洲猪瘟病毒感染猪的肺脏、肝脏、肾脏、脾脏等组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品约10 g于组织匀浆器或研钵中充分匀浆或研磨，加入0.3 ml0.5 ml组织悬液混匀，60，30 min灭活后，将悬液转入无菌Eppendorf管中，4 条件下5000 r/min离心10 min，编号备用。6.1.4 全血及血清样本的采集与前处理 使用含有抗凝血剂（EDTA-紫色盖）的无菌管（真空采血管）从耳静脉或前腔静脉采集血液3 ml5 ml，60，30 min灭活后，可直接检测；若检测血清，可静置全血样本待血清析出后，直接吸取至无菌Eppendorf管中，60，30 min灭活后，编号备用。6.1.5 存放与运输 采集或处理的样品在28 条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在8 h之内运送到实验室检测。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。6.2 样品 DNA 的提取 取10 l前处理过的样本加入无菌1.5 ml离心管，加入10 l样品处理剂，混匀，94 裂解2 min，瞬时离心，上清即为扩增模板。6.3 核酸扩增 6.3.1 吸取 22 l ASFV-R-Mix 和 1 l Bst enzyme 加入同一个 PCR 管，吸取 2 l 步骤 6.2 处理的核酸扩增模板加至 PCR 管，混匀，设置阴阳性对照；6.3.2 吸取 10 l D-I 矿物油轻轻加至 PCR 管液面，切勿震荡混匀；6.3.3 插入到恒温扩增仪反应槽中；6.3.4 设置恒温扩增仪器反应条件为：65 反应 12 min，荧光采集周期 20 s。7 试验成立条件与结果判定 7.1 试验成立条件 使用前用阴、阳性对照进行该检测方法评价，若阳性对照CT值40，阴性对照CT值40，则检测结果有效。DB21/T 32562020 3 7.2 结果判定 若CT值40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性；若CT值40，样品应判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性 8 实验室生物安全要求 按照GB19489 实验室生物安全通用要求执行。DB21/T 32562020 4 A A 附 录 A（规范性附录）试剂配制 A.1 样品处理剂的制备量取80 ml PBS（0.01 mol/L，pH值7.4），加入10 l NP40（乙基苯基聚乙二醇），无菌纯化水定容至100 ml，定量分装，500 l/管，-20 保存。A.2 ASFV-R-Mix的制备A.2.1 引物合成根据非洲猪瘟病毒p72基因片段的保守结构域设计3对引物，包括1对内引物（FIP与BIP）、1对外引物（F3与B3）和1对环引物（LF与LB），均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列为：FIP：5-TAACGCCACTATGCAGCCCACGGAAGAGCTGAATCTCTATCCT-3 BIP：5-CAACATGTGCGAACTTGTGCCACATACCTGGAACGTCTCC-3 F3：5-ATAGGTAATGCGATCGGATACA-3 B3：5-CCAACAATAACCGCCACGC-3 LF：5-TCGCCACGCAAAGATAAGC-3 LB：5-AGCCTCGGTGTTGATGCGGATT-3 A.2.2 引物混合物的制备取3对引物（FIP、BIP、F3、B3、LF和LB）干粉，按引物说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混匀，得到各引物溶液，置-20 保存。A.2.3 ASFV-R-Mix的配制称取2.4 g Tris，0.37 g氯化钾，0.12 g硫酸镁，100 l吐温-20，7.029 g甜菜碱，溶于80 ml纯化水，依次加入终浓度为1.4 mmol/L dNTPs溶液、0.2 mol/L外引物溶液、1.6 mol/L内引物溶液、0.8 mol/L环引物溶液，加入无菌纯化水定容至100 ml，经过0.22 m滤器过滤除菌，分装至2 ml蓝盖可立冻存管中，1.1 ml/管，-20 保存。A.3 Bst enzyme的制备用于制备本试剂盒的Bst enzyme为商品化DNA聚合酶，按使用说明书用纯化水稀释至4106/L，分装至0.5ml白盖可立冻存管中，100/l管，-20 保存。A.4 D-I矿物油用于制备本试剂盒的D-I矿物油为商品化矿物油，分装至2 ml黄盖可立冻存管中，500 l/管，-20 保存。A.5 阳性对照采用核酸蛋白质分析仪测定阳性质控品浓度，计算质粒拷贝数，用纯化水将其稀释为103拷贝/l，分装至0.5 ml红盖可立冻存管中，100 l/管，-20 保存。A.6 阴性对照取纯化水，分装至0.5 ml绿盖可立冻存管中，100 l/管，-20 保存。DB21/T 32562020 5 _