DB42T 789-2012 猪链球菌2型ELISA抗体检测方法.pdf

ICS11.220B 41备案号：DB42湖北省地方标准DB42/T 7892012猪链球菌 2 型 ELISA 抗体检测方法Method of the enzyme-linked immunosobent assay for the detection of atibodiesagainst swine streptocosus suis serotype 22012-01-06 发布2012-03-01 实施湖北省质量技术监督局发 布DB42/T 7892011I目次前言.II引言.III1范围.12缩略词.13实验原理.14实验条件.15实验材料.16样品处理.17实验方法.28结果判定.29注意事项.2附录 A.3DB42/T 7892011II前言本标准按 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本标准由华中农业大学提出。本标准由湖北省农业厅归口。本标准起草单位：华中农业大学动物医学院、武汉科前动物生物制品有限责任公司、湖北省动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：金梅林、康超、张安定、钟广汉、周艳君、董晓辉、陈焕春、徐高原、孙小美、李淑云、宋念华。DB42/T 7892011III引言猪链球菌（Streptococcus suis,SS）是一种能引起猪发病的重要致病菌，往往造成猪群感染和大量死亡，同时严重危害人类健康甚至导致死亡。根据荚膜多糖分型，猪链球菌可分为 33 个血清型，其中猪链球菌 2 型是毒力最强、流行最广的血清型。为了有效地预防和控制猪链球菌 2 型病，制定了猪链球菌 2 型 ELISA 抗体的检测方法，本方法快速、简便，易操作，是监测猪 2 型链球菌病的重要方法。DB42/T 78920111猪链球菌 2 型 ELISA 抗体检测方法1范围本标准规定了猪链球菌 2 型 ELISA 抗体的检测方法的缩略词、实验原理、实验条件、实验材料、样品处理、实验方法、结果判定和注意事项等。本标准适用于检测猪血清中的猪链球菌 2 型抗体。2缩略词下列术语和定义适用于本文件。ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）：酶联免疫吸附试验OD630nm值：630纳米波长处的吸光值3实验原理酶联免疫吸附试验是将抗原吸附在固相载体上，加入待检抗体，再加相应的酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。本方法中采用冷酚抽提法，提取并纯化猪链球 2 型菌的荚膜多糖，以其作为包被抗原，建立检测猪链球菌 2 型抗体的 ELISA 检测方法。4实验条件4.1实验室实验操作宜在常温（18 25）进行。4.2仪器抗原包被板、微量移液器、移液器吸头、酶标检测仪、恒温箱、冰箱。4.3人员注意个人防护和环境保护。5实验材料20 倍浓缩洗涤液、样品稀释液、酶标记抗体、底物液 A、底物液 B、终止液、阳性对照血清、阴性对照血清。配方见附录 A。6样品处理DB42/T 789201126.1样品采集取动物全血，待血液凝固后，4,000 r/min 离心 10 min，收集上清。要求血清清亮，无溶血。6.2洗涤液配制使用前，将 20 倍浓缩洗涤液恢复至室温（20 25），并摇动使沉淀溶解（37 水浴锅中加热 5 min10 min），然后用蒸馏水稀释 20 倍，混匀，稀释好的洗涤液在 2 8 贮存，7 d 内使用。6.3样品和对照血清稀释处理后的样品按 1:40 的比例稀释；阳性和阴性对照血清用样品稀释液按 1:40 稀释。7实验方法7.1取抗原包被板，用洗涤液洗板 1 次（200 L/孔）后在吸水纸上拍干。7.2加入稀释好的样品，每孔 100 L，同时设阴、阳性对照孔，每孔 100 L，置 37 作用 30 min。7.3弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 200 L，静置 3 min 后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板 5 次。7.4加入酶标记抗体，100 L/孔，置 37 作用 30 min。7.5弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 200 L，静置 3 min 后，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，重复洗板 5 次。7.6每孔加底物液 A、底物液 B 各 50 L，混匀，室温避光显色 10 min。7.7每孔加入终止液 50 L，混匀后测定结果。7.8以空白对照孔调零，用酶标仪测定各孔的 OD630nm值。测定结果必须在加入终止液后 10 min 内完成。8结果判定试验成立的条件是阳性对照孔 OD630nm值0.8，阴性对照孔 OD630nm值0.3。如果样品 OD630nm值0.35，判为阳性；如果样品 OD630nm值0.35，判为阴性。9注意事项实验过程中注意做好个人的生物安全防护措施，废弃物应做无害化处理。DB42/T 78920113AA附录A（规范性附录）试剂的配置A.1样品稀释液的配制脱脂乳50 g氯化钠（NaCl）160 g氯化钾（KCl）4 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）58 g磷酸二氢钾（kH2PO4）4 gTween-205 mL硫柳汞钠0.1 g加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL,经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，50 mL/瓶。A.220 倍浓缩洗涤液的配制氯化钠（NaCl）160 g氯化钾（KCl）4 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）58 g磷酸二氢钾（kH2PO4）4 gTween-205 mL加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL,经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，50 mL/瓶。A.3酶标记抗体的配制酶标记抗体0.2 mL氯化钠（NaCl）160 g氯化钾（KCl）4 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）58 g磷酸二氢钾（kH2PO4）4 gTween-205 mL硫柳汞钠0.1 g加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL,经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，20 mL/瓶。A.4底物液A 的配制磷酸氢二钠（Na2HPO4）14.6 g柠檬酸9.33 g过氧化氢脲0.52 gDB42/T 78920114加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL，调至 pH 值至 5.05.4,经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，12 mL/瓶。A.5底物液B的配制无水乙醇10 mL联苯二胺(TMB)20 g加蒸馏水或去离子水定容至 1000 mL，调至 pH 值至 5.05.4,经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，12 mL/瓶。A.6终止液的配制氢氟酸（HF）6.25 mL，加注射用水至 1000 mL，经 0.22 m 滤膜过滤后，无菌分装，12 mL/瓶。_