DB21T 2326-2014 猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB 21/T 23262014 猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR 检测方法 Method of real time fluozescent PCR for the detection of pseudorabies virus 2014-07-05 发布 2014-09-05 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 23262014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：陈瑶、赵晓彤、于学武、赵凤菊、于长泳、张雅为、刘坤洋、杨国丽、邓文超、高志峰、关淼、李连昭、杨松柏 DB21/T 23262014 1 猪伪狂犬病毒实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）gG 和 gE 基因的荧光 PCR 检测方法的实验技术要求。本标准适用于 PRV 的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪脏器、血液和细胞培养物中 PRV 核酸的检测，以及根据免疫背景对 gE 基因缺失疫苗毒与野毒感染的鉴别检测。本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。PRV：猪伪狂犬病毒（pseudorabies virus）HS Taq 酶：热启动 Taq DNA 聚合酶(HS Taq DNA polymerase)Ct 值：达到阈值的循环数(cycle threshold)DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)荧光 PCR：荧光聚合酶链式反应(real time fluozescent quantitative polymerase chain reaction)PBS：磷酸缓冲液（phosphate buffer solution）4 原理 SYBR Green是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与通过PCR反应产生的双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，通过检测反应体系中SYBR Green荧光强度，同时测定扩增产物DNA的熔解温度，分析PCR扩增产物的单一性，以达到检测PCR产物扩增量的目的。5 仪器和器材 5.1 仪器 分析天平、高速离心机、荧光 PCR 扩增仪、-70冰箱、-20冰箱、水浴锅、可调移液器（最大量程为 2L，20L，200L，1000L）。5.2 器材 DB21/T 23262014 2 组织匀浆器或研钵、眼科剪、眼科镊、10 mL 一次性注射器、1.5 mL 灭菌离心管、PCR 八联排管或 96 孔板、吸头（10L，200L，1000L）、灭菌双蒸水、称量纸。6 试剂和材料 6.1 DNAzol Reagent：DNA 抽提试剂，外观为淡绿色，于 4 8 保存。6.2 SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）：SYBR Green嵌合荧光法进行 Real Time PCR反应的专用试剂，为 PCR Buffer、dNTP、RNaseH、HS Taq 酶以及 SYBR Green染料的预混液，于-20长期保存，融化后于 4 8 保存。6.3 PBS：磷酸盐缓冲液（0.02 mol/L pH7.2）。6.4 无水乙醇：-20预冷。6.5 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20预冷。6.6 阴性对照：灭菌双蒸水。6.7 阳性对照：PRV 细胞培养物。注：本标准所用试剂，除特殊标注外，均为分析纯。7 操作步骤 7.1 样品的采集、前处理、存放和运送 7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2 采样工具 药匙、15 mL 离心管和 1.5 mL 离心管经 121（2）高压灭菌 15 min；剪刀、镊子经 160 干热灭菌 2 h。7.1.3 内脏样品的采集与前处理 采取病死或剖杀猪主要脏器（脑、淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏）装入灭菌 15 mL 离心管中，编号，送实验室。取 100 mg 左右待检样品，按 1:5 倍体积加入 PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1 000 g 离心 15 min，取上清液，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。7.1.4 血液样品的采集与处理 用无菌注射器采集血液，注入含1/10 4%EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。7.1.5 细胞培养物 细胞培养物冻融 3 次，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。7.1.6 存放与运送 DB21/T 23262014 3 采集或处理的样品在 28 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 68 h 之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2 实时荧光 PCR 检测 7.2.1 DNA 提取 在核酸提取室进行。7.2.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。7.2.1.2 每管加入 800 L DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 L，颠倒 10 次混匀，室温静置 5 min；4 10 000 g 离心 10 min。7.2.1.3 取 900L 上清，置新的 1.5mL 灭菌离心管中，加入 500 L 无水乙醇，混匀，室温放置 3 min；4 10 000 g 离心 5min。7.2.1.4 弃上清，沿管壁缓缓加入 1mL 75%乙醇，混匀，4 10 000 g 离心 5min。反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。7.2.1.5 用 20 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20 冰箱保存备用。7.2.2 扩增体系的配制 在配液区进行。配制 gE 基因扩增反应液，设实时荧光 PCR 反应数为 n，其中 n 为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个样本检测反应体系配制见表 1，向每个荧光 PCR 管或孔中分装 23L 的反应体系。gG 基因扩增反应液配制方法同 gE 基因。表1 每个样品反应体系配制表 体系组分 用量 终浓度 备注 SYBR Premix Ex Taq（2）12.5L 1 上游引物 F 0.25L 0.2mol/L 下游引物 R 0.25L 0.2mol/L ROX Reference Dye（50）0.5L 1 仅使用在 ABI、Stratagene 等公司的荧光 PCR 扩增仪上 灭菌双蒸水 10L/9.5L 总量 23L DB21/T 23262014 4 7.2.3 加样 在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管中加入7.2.1中制备的2 L DNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。7.2.4 荧光 PCR 扩增检测 在扩增室进行。7.2.4.1 将 7.2.3 中离心后的 PCR 管放入荧光 PCR 扩增仪内，注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。7.2.4.2 gE 和 gG 基因扩增反应条件均为：95 30s；95 5s，60 30s，40 个循环。荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行；在扩增反应结束后，分析熔解曲线。8 结果判定 8.1 阈值设定 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和 Ct 值直接读取检测结果，Ct 值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无 Ct 值，且无典型扩增曲线；或阴性对照 Ct 值35.0，出现扩增曲线，但 gE 基因熔解曲线于 88左右未出现明显的峰值，gG 基因熔解曲线于 84左右未出现明显的峰值。8.2.2 阳性对照 Ct 值35.0，出现扩增曲线，但 gE 基因熔解曲线于88左右未出现明显的峰值，表示样品中无 PRV 核酸。8.3.1.2 阳性 Ct 值35.0，出现典型的扩增曲线，且 gE 基因熔解曲线于 88左右出现明显的峰值，表示样品中存在 PRV 核酸。8.3.1.3 可疑 30.0Ct 值35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。8.3.2 gG 基因 DB21/T 23262014 5 8.3.2.1 阴性 无 Ct 值并且无典型的扩增曲线；或阴性对照 Ct 值35.0，出现扩增曲线，但 gG 基因熔解曲线于84左右未出现明显的峰值，表示样品中无 PRV 核酸。8.3.2.2 阳性 Ct 值35.0，出现典型的扩增曲线，且 gG 基因熔解曲线于 84左右出现明显的峰值，表示样品中存在 PRV 核酸。8.3.2.3 可疑 30.0Ct 值35.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果为阳性者判为阳性，否则为阴性。8.4 鉴别检测 针对免疫 gE 基因缺失活疫苗猪群，gE 基因及 gG 基因均阳性，表示有野毒感染；gE 基因阴性，而 gG 基因阳性，为苗源病毒。DB21/T 23262014 6 附 录 A（规范性附录）A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000mL，混匀。A.1.2 0.2 mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H20）31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至 1000 mL，混匀。A.1.3 量取 0.2 moL/L 磷酸氢二钠溶液 360 mL，0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液 140 mL，称取氯化钠 38 g，用无离子水溶解稀释至 5000 mL，4保存。A 录 C（规范性附 _