细胞工程-第三章-植物组织培养技术4.ppt

LOGOLOGO 第六节第六节 植物细胞的选育与改良植物细胞的选育与改良 筛选、诱变筛选、诱变 原生质体融合、基因重组原生质体融合、基因重组 CELLCELL Company Logo 为什么进行植物细胞的筛选?植物细胞往往不均一，会显示出不同的特性，需要将具有优良特性的细胞选择出来。植物细胞在培养过程中会发生变异，通过筛选将有利的变异细胞选出，而把不利的变异细胞去除。诱变获得的突变体，通过原生质体融合获得的融合子和通过基因重组获得的工程细胞 Company Logo 自发突变 体细胞无性系变异：植物细胞在体外培养过程中往往发生不可期的突变，且突变性状可以稳定遗传。其变异可发生在单基因控制的性状上，也可以发生在多基因控制的性状上，而且可同时发生在胞质基因和核基因控制的性状上。染色体数目发生改变，或染色体结构发生改变如染色体易位、缺失、倒位、点突变等。造成这些改变的原因，普遍认为是由培养条件和培养基成分尤其是激素如2，4-D、细胞分裂素引起的。自发突变的频率约为10-810-5 变异的类型(从表型上)主要表现在：生长习性、株高、主茎长、主枝数、产量、花色、抗除草剂、抗旱、抗盐、抗寒、代谢产物突变、抗病、抗虫 Company Logo 诱发突变 提高突变频率到10-3 物理法和化学法：X射线、射线、紫外线、中子、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基脲等。 Company Logo 植物细胞突变体的应用植物细胞突变体的应用 为细胞杂交和基因导入提供选择标记如携带标记基因Gus的细胞系 细胞、分子水平的遗传和代谢研究 对农作物性状进行遗传改良 提高植物细胞中有用代谢产物的含量 从组织水平和细胞水平上筛选突变体，较之整体植物有许多优点 LOGOLOGO 植物细胞筛选的方法植物细胞筛选的方法 小细胞团筛选法 选择压力筛选法 CELLCELL Company Logo 小细胞团筛选法 制备得到单细胞，在常规的培养基中经过单细胞培养，形成细胞团，通过观测细胞团的形态、颜色或者测定细胞代谢物的种类和含量，从而选出所需的细胞。实例 筛选花色苷含量高的玫瑰茄细胞 Company Logo 选择压力筛选法 通过添加某些对不同的细胞有不同作用效果的物质，淘汰部分敏感细胞，而选择得到所需的细胞。正选择：把受选择的细胞群体臵于一定的选择压力之下，部分细胞在选择压力的作用下受到淘汰，而有一些耐受抗选择压力的细胞可以生长，从而选择得到所需的细胞。一步和多步选择 NaCl为选择剂选择耐盐突变体 以除草剂为选择剂选择抗除草剂突变体 负选择：选择的对象是在一定选择压力的作用下不能生长的那些细胞，而能够生长的细胞受到淘汰。适用于对营养缺陷型突变体的选择。 Company Logo 选择压力筛选法 直接选择：所用的选择压力正是以后在整体植株水平上突变表现型的作用对象。实例：抗性突变体的选择，用生长抑制剂如抗生素、代谢类似物、某些金属及非金属离子等，来分离培养植物细胞，从中选择对生长抑制剂具有抗性的突变细胞，关键是对生长抑制剂浓度的选择。间接选择：选择压力不是突变表现型对其直接表现抗性的物质。实例：营养缺陷突变体、温度敏感型突变体及抗旱细胞突变体等的筛选 Company Logo 影响细胞筛选效果的因素 亲本材料对筛选效果的影响 培养方式对细胞筛选效果的影响 愈伤组织培养：生长速率比较慢；并非所有的细胞都能与培养基直接接触；细胞之间的接触相当紧密；细胞悬浮培养：以大小不一的细胞团形式存在；释放的有毒物的影响较大；原生质体培养：分离和培养技术还不完善；细胞生长速度对细胞筛选效果的影响 选择压力的施加方式对细胞筛选效果的影响 一次性施加和逐步施加 LOGOLOGO 植物细胞的诱变 物理诱变 化学诱变 CELLCELL Company Logo 诱变的概念、形式 诱变：指通过各种诱变剂的作用，使细胞发生变异的过程，是获得优良植物细胞的有效方法之一。物理诱变剂包括X射线、射线、中子、a粒子、粒子、紫外线等。紫外线的能量较低，不能引起被照射物质的离子化，因而叫做非电离诱变因子；其余的物理诱变剂均能引起被照射物质的离子化，称为电离诱变因子。化学诱变剂的种类较多，根据对DNA的作用特点，主要分三类，包括碱基类似物、烷化剂、叠氮化合物。诱发配对错误/诱发染色体断裂/改变DNA的化学结构 Company Logo 如何进行诱变 诱变的基本过程：单细胞制备、预培养、诱发突变、突变细胞株的选择 诱发突变一般采用平板培养法，并在培养基中加入某种选择因子，长时间饲喂培养植物细胞，使其发生拟定目标的突变。一般认为所得到的突变体只有满足以下条件，才能表明已发生真实的突变：离开选择压后变异表型保持稳定；突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异；变异表型能够通过有性繁殖遗传，其中变异的性状遗传稳定性是鉴定突变体最为可靠的标准， Company Logo 植物细胞诱变实例 对氨基酸和氨基酸类似物抗性的选择 抗病细胞突变体的选择 抗除草剂细胞突变体的选择 植物抗盐细胞突变体的选择 抗低温(或高温)突变体和抗旱突变体(抗逆境)高光效突变体/营养缺陷型细胞突变体的选择 LOGOLOGO 植物细胞的基因重组与转移 外源基因的获取、载体的制备、基因的体外重组、基因的转移和外源基因的表达 CELLCELL Company Logo 植物细胞基因转移的方法 农杆菌介导法 直接转化法 基因枪法 电激法 显微注射法 脂质体介导法 病毒载体转导法 Company Logo 农杆菌介导法 利用农杆菌（Agrobacterium）的Ti或Ri质粒携带外源基因进入植物细胞（组织、器官或植株）的过程称为农杆菌介导的基因转移。植物细胞、组织、器官共培养法：该方法是以贺斯克（Horsch）等人1985年建立的叶盘法为基础发展起来的，是双子叶植物细胞基因转移的较为常用的简单有效的方法。植株感染法：一般采用种子实生苗或试管苗作为外植体,在整体植株上造成创伤,然后把农杆菌接种于创伤面上,或用针头把农杆菌注射到植物体内,使其进行侵染转化。原生质体共培养法：是指将处于再生壁时期的原生质体与农杆菌一起共培养。 Company Logo 直接转化法 直接转化法：即用裸露的DNA经特殊处理后，直接转移到植物细胞和原生质体中，导致细胞转化的技术。基因枪法：是由克雷因（Klein）等在1987年建立的基因导入方法。其原理是将DNA包裹于微小的金属钨或金粒的表面，在高压下使金属颗粒喷射，高速穿透受体细胞或组织，使外源基因进入受体细胞核并整合表达的过程。化学药剂诱导法：植物的原生质体在没有载体的情况下，借助一些化学试剂的诱导能够吸收外源DNA、质粒等遗传物质，并有可能整合到植物细胞染色体中去。电激法（electroporation）：又称电穿孔法，是在高压电脉冲作用下在新鲜分离的原生质体的质膜上形成可逆性的瞬间通道，从而发生外源DNA的摄取。显微注射法（microinjeceion）：这是利用特制的显微注射仪将外源遗传物质注入植物细胞的转化方法。低能离子束法（Ionimplantation）/激光束法 Company Logo 其他方法 花粉管通道转化法：利用开花植物授粉后形成的花粉管通道，在植物开花以后，去除柱头，直接利用外源的DNA进行涂抹，使外源的DNA借助业已形成的花粉管通道转入卵、合子或早期胚胎细胞，实现目的基因的转移。脂质体介导转化法 病毒载体转导法 Company Logo 转基因植物细胞的筛选与检测 负向筛选体系 负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类，除草剂类或其它类似物具有解毒作用，使其变为解毒的抗生素的衍生物，从而使转基因的细胞对抗生素等不敏感，而未转基因的细胞对抗生素等敏感而被杀死。这些使用除草剂和抗生素作为选择性物质的筛选体系虽然目前应用的比较广泛，但是选择性标记基因与目的的基因并无关系，对植物有负面影响，它的使用和释放也给环保带来了一些问题。而且由于抗生素和除草剂等的毒性作用导致植物的转化和再生频率很低。 Company Logo 抗生素类筛选体系 卡那霉素筛选体系：应用最广泛的选择体系，它是用新霉素磷酸转移酶（NPT）基因作为选择标记基因，用卡那霉素、新霉素和G418作为选择性物质加入培养基中进行筛选。潮霉素筛选体系：在植物转化中使用的另一个编码解毒蛋白的基因是来自大肠杆菌的潮霉素磷酸转移酶基因（HPT）。链霉素和壮观霉素筛选体系/庆大霉素筛选体系 博来霉素筛选体系/氯霉素(chlorampenicol)的筛选体系 其它抗生素类筛选体系有抗膦丝菌素(phosphinothricin)的磷丝菌素筛选体系等。 Company Logo 除草剂类筛选体系 磺胺类筛选体系 EPSPS筛选体系：将细菌的5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate合成酶(EPSPS)基因转入高等植物的叶绿体，在转基因植株中获得一种除草剂（Glyphosate）的抗性。双丙氨酸草甘膦筛选体系 绿磺隆类筛选体系 Company Logo 正向筛选体系 正向筛选体系中的选择剂兼具两种功效，首先，由于转化体细胞含有编码可以利用这种选择剂的基因，所以转化体细胞可以利用这种选择剂进行新陈代谢，促进转化体细胞的生长；其次，选择剂还可以用来筛选转化体，转化体细胞由于利用了这种物质而生长较快，生长旺盛，然而非转化体由于不能利用这种选择剂而生长缓慢或受到抑制，从而可以筛选出转化体。这种正向筛选体系可以大大提高植物转基因中转化频率和再生频率低的难题，为加速植物转基因产业化进程提供了有效的工具。 Company Logo GUS筛选体系 将葡糖苷酸酶（-glucurouidase，GUS)基因，连同于目的基因转化到植物细胞中，转化的细胞中GUS基因能激活惰性细胞激动素(苄基腺嘌呤N-3葡糖苷酸)，使其变成活性的细胞激动素(苄基腺嘌呤)，苄基腺嘌呤能够刺激转基因细胞的再生和生长，而非转化的植物细胞由于不含GUS基因则不能利用苄基腺嘌呤N-3葡糖苷酸，转化的细胞由于这种新陈代谢的优越性，所以生长旺盛，而非转化的植物细胞则生长缓慢，从而达到筛选的目的，而且选择剂(苄基腺漂呤N-3葡糖苷酸)对植物细胞无任何不利影响。 Company Logo 其它筛选体系 甘露糖筛选体系 木糖筛选体系 氨甲喋呤抗性基因的检测 冠瘿碱合成酶基因筛选体系 荧光素酶基因筛选体系 PCR检测 点杂交和DNA杂交/Southern杂交 RNA杂交/Northern杂交 蛋白质杂交/Western杂交 LOGOLOGO 第七节第七节 植物细胞培养技术的应用植物细胞培养技术的应用 各种代谢产物 CELLCELL LOGO 植物细胞培养得到的常见次级代谢物植物细胞培养得到的常见次级代谢物 紫草宁 小檗碱（黄连素）花青素，花黄素 银杏黄酮 银杏内酯 白果内酯 蒽醌 青蒿素 超氧化物歧化酶木瓜蛋白酶 木瓜凝乳蛋白酶 香豆素 薄荷醇 人参皂甙 类胰岛素 紫杉醇 地高辛 利血平 奎宁碱 长春花碱 尼古丁 鱼腾酮 迷迭香酸 紫草细胞 黄连细胞 玫瑰茄细胞，紫苏细胞 银杏细胞 银杏细胞 银杏细胞 巴戟天细胞 黄花蒿细胞 大蒜细胞 番木瓜细胞 番木瓜细胞 胡桐细胞，薰衣草细胞 薄荷细胞 人参细胞 苦瓜细胞 红豆杉细胞 毛地黄细胞 罗夫木细胞 金鸡纳细胞 长春花细胞 烟草细胞 鱼藤细胞 鼠尾草细胞，鞘心花细胞 色素，消炎 消炎、止泻 食用色素，抗氧化 疏通血管，抗氧化 治疗心血管疾病 治疗大脑和神经系统疾病 抗菌消炎，抗肿瘤 抗疟疾，退热药 抗氧化、抗辐射、抗衰老 消炎，肉质嫩化 治疗骨质增生，血型检测 抗病毒，香精 食用香精 调节免疫功能，保健 治疗糖尿病 抗肿瘤 强心药 降血压 抗疟疾 治疗白血病 杀虫 杀虫 消炎，抗氧化 LOGO 1 1、植物细胞次级代谢物生物合成的简要途径、植物细胞次级代谢物生物合成的简要途径 CO2,H2O单糖丙酮酸乙酰辅酶A甲戊二羟酸（甲瓦龙酸）萜、甾多酮某些醌类脂肪酸油脂莽草酸预苯酸芳香酪氨酸多肽生物碱类脂肪族氨基酸桂皮酸香豆素木脂素黄酮类 LOGO