DB65T 3501-2013 绵羊卵母细胞体外受精技术操作规程.pdf

DB65/T3501-20136.1.3.4精液稀释是在水浴锅中进行，用移液枪轻轻将精液移入预热好玻璃试管中，并读取刻度，确定加入精液稀释液的量，移液枪吸取已预热稀释液，轻轻打入玻璃管底部（切忌用力过猛和一次全部将稀释液打入)，然后从液面吸取部分，再将移液枪伸入管底，打出部分，这样反复吸打混匀。然后再吸取部分稀释液，操作同上，直到达到所要稀释的刻度。6.1.3.5用铝箔纸包好精液管，标出种羊的号码和日期；放入200ml水浴锅温水烧杯中，置于4的冰箱中过夜获能备用。6.2体外受精的准备62.1在体外受精前一天，配制体外受精液，放入冰箱冷藏中。6.2.2受精前(23)h,平衡受精液。培养皿盖上标出，V和日期；将受精液点入培养皿中，每个培养皿7个滴，每滴加50l受精液，覆盖3ml石蜡油，放入培养箱中平衡。62.3洗皿用记号笔标上1、2和3，每皿加入2ml的受精液；同时准备一个空皿，放入培养箱平衡。6.2.4精液上浮管按照每2个培养滴一个试管，每管移入0.5ml的受精液，放入培养箱中平衡。6.2.5用75%的酒精喷体视镜上的恒温板与体视镜周围的台面上，然后用已消毒过的纸巾擦干。6.2.6在酒精灯上拉直径小于250m的吸管，并在体视镜下检查管口是否平整，放好备用；用于吹打掉卵母细胞周围已扩散的部分颗粒细胞层。6.3精液上浮6.3.1准备工作6.3.1.1恒温水浴锅准备，检查恒温水浴锅中水量，打开，定温到(3637)。6.3.1.2将8ml玻璃试管和载玻片放在恒温板上预热。6.3.2精液上浮6.3.2.1在体外受精前30min,将8ml玻璃试管置于水浴锅内.6.3.2.2从4冰箱取出精液（带烧杯一起取出），用移液枪从中移出300ul,慢慢放入水浴锅内的试管底部，轻轻摇动试管，均匀受热(3040)s后。6.3.2.3检查精液的品质，如精液品质良好，用移液枪移取50l,轻轻打入培养箱内精液上浮管中（移液枪头放至管底，每管50ul),放入培养箱中，上浮时间最少20min,切忌振荡上浮管。6.4体外受精(IVF)6.4.1根据入孵的时间依次进行体外受精。6.4.2将3个受精液洗皿和受精盘取出，放入加热台的黑盒子里；将受精液液体倒入空皿(H皿)。6.4.3从培养箱中取出成熟盘，放在体视镜下观察卵母细胞的成熟情况，成熟后的卵母细胞颗粒细胞发生扩散。6.4.4用吸管将四孔盘中成熟的卵母细胞移入H盘中，对卵母细胞稍微吹打，迅速移入1号受精液洗皿中，将1号受精液洗皿放回黑盒子，检查四孔盘中是否还有未吸出的卵母细胞；然后将1号受精液洗皿中的卵母细胞移入2号受精液洗皿，再移入3号受精液洗皿，最后移入受精培养皿中，放回培养箱。6.4.5用移液枪从精液上浮管的最上层移取(5080)l上浮精液密度约210个，最终密度每ml为210个，轻轻打入受精滴中，标住每孔的卵母细胞数量、公羊号，放入培养箱培养条件：5%C02、38.6、(2630)h。记录IVF时间，填写附表4。6.4.6体外受精时，每滴最多放入30枚卵母细胞7胚胎的体外培养(1VC)7.1准备工作7.1.1将培养液放入培养箱中，松开瓶盖，平衡23h。7.1.2胚胎培养液洗皿的准备，每皿2l培养液，放入培养箱中平衡。7.1.3将培养液移入四孔盘中，每孔500l,加盖300l矿物油，标出IVC和日期，放入培养箱中平