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DB12T 506-2014 大豆转基因成分筛查方法.pdf
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DB12T 506-2014 大豆转基因成分筛查方法 506 2014 大豆 转基因 成分 方法
B 04 ICS 65.020.01 天津市地方标准 DB12DB12/T 5062014 大豆转基因成分筛查方法 Screening method for genetically modified soybean 2014-04-22 发布 2014-07-20 实施天津市质量技术监督局发布 天津市质量技术监督局发布 DB12/T 5062014 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由天津市质量技术监督局提出。本标准起草单位:天津市东丽区产品质量监督检验所、天津市农业质量标准与检测技术研究所。本标准主要起草人:黄凤军、陈杰、朱珠、李建、马强、赵新、龙起成、陈慧。本标准 2014 年 04 月首次发布。DB12/T 5062014 1 大豆转基因成分筛查方法 1 范围 本标准规定了大豆中转基因成分定性 PCR 筛查的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于大豆及其制品中 Lectin 内标准基因、CaMV35S 启动子、NOS 终止子、CP4-epsps 基因、Bt 基因和 bar/pat 基因的定性 PCR 筛查检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。3.2 CaMV 35S 启动子 35S promoter from cauliflower mosaic virus(CaMV)来自花椰菜花叶病毒的 35S 启动子。3.3 NOS 终止子 terminator of nopaline synthase(NOS)gene 来自胭脂碱合成酶基因 NOS 的终止子。3.4 CP4-epsps 基因 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene derived from Agrobacterium sp.CP-4。来源于土壤农杆菌株系(Agrobacterium sp.)CP4 株系一段可编码 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶的基因。3.5 Bt 基因 Bt(Bacillus thuringiensis)gene 来源与苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),可表达一种杀虫晶体蛋白的基因,常见的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/cry1Ac融合基因。3.6 bar/pat 基因 bialaphos resistance gene/phosphinothricin acetyltransferase gene DB12/T 5062014 2 bar 基因来源于土壤吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus),pat 基因来源于绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogens),均编码膦丝菌素乙酰转移酶(phosphinthricin acetyltransferase,PAT),该酶具有对除草剂草丁膦(glufosinate)的耐受性。bar 基因和 pat 基因具有较高的同源性。4 检测方法 4.1 试剂和材料 4.1.1 实验用水为重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。4.1.2 琼脂糖。4.1.3 10 g/L 溴化乙锭溶液:称取 1.0 g 溴化乙锭(EB),溶于 100 mL 水中,避光保存。注:溴化乙锭有致癌作用,配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。4.1.4 10 mol/L 氢氧化钠溶液:在 160 mL 水中加入 80.0 g 氢氧化钠(NaOH),溶解后再加水定容到 200 mL。4.1.5 500 mmol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(pH 8.0):称取 18.6 g 乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2),加入 70 mL 水中,再加入适量氢氧化钠溶液(4.1.4),加热至完全溶解后,冷却至室温,用氢氧化钠溶液(4.1.4)调 pH 至 8.0,加水定容至 100 mL。在 103.4 kPa(121)条件下灭菌 20 min。4.1.6 1 mol/L 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH 8.0):称取 121.1 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶解于 800 mL 水中,用盐酸调 pH 至 8.0,加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa(121)条件下灭菌 20 min。4.1.7 TE 缓冲液(pH 8.0):分别量取 10 mL 三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(4.1.6)和 2 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),加水定容至 1 000 mL。在 103.4 kPa(121)条件下灭菌 20 min。4.1.8 50TAE 缓冲液:称取 242.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用 300 mL 水加热搅拌溶解后,加 100 mL 乙二铵四乙酸二钠溶液(4.1.5),用冰乙酸调 pH 至 8.0,然后加水定容到 1 000 mL。使用时用水稀释成 1TAE。4.1.9 加样缓冲液:称取 250.0 mg 溴酚蓝,加 10 mL 水,在室温下溶解 12 h;称取 250.0 mg 二甲基苯腈蓝,用 10 mL 水溶解;称取 50.0 g 蔗糖,用 30 mL 水溶解。混合以上三种溶液,加水定容至 100 mL,在 4 下保存。4.1.10 DNA 分子量标准:可以清楚的区分 50 bp1 000 bp 的 DNA 片段。4.1.11 dNTPs 混合溶液:将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。4.1.12 Taq DNA 聚合酶、PCR 反应缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。4.1.13 引物引物:大豆内标准基因和转基因大豆外源基因检测时所用的引物序列见表 1。表 1 大豆内标准基因和转基因大豆外源基因引物序列 检测基因 引物序列 扩增片段长度 基因性质 Lectin lec-1672F:5-GGGTGAGGATAGGGTTCTCTG-3 lec-1881R:5-GCGATCGAGTAGTGAGAGTCG-3 210 bp 内标准基因 CaMV 35S 35S-F:5-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3 35S-R:5-GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCC-3 195 bp 外源基因 NOS NOS-F:5-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3 NOS-R:5-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3 180 bp 外源基因 DB12/T 5062014 3 CP4-epsps mCP4ES-F:5-ACGGTGAYCGTCTTCCMGTTAC-3 mCP4ES-R:5-GAACAAGCARGGCMGCAACCA-3 333 bp 外源基因 Bt Bt-F:5-GAAGGTTTGAGCAATCTCTAC-3 Bt-R:5-CGATCAGCCTAGTAAGGTCGT-3 301 bp 外源基因 bar bar-F:5-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3 bar-R:5-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3 262 bp 外源基因 pat pat-F:5-GAAGGCTAGGAACGCTTACGA-3 pat-R:5-CCAAAAACCAACATCATGCCA-3 262 bp 外源基因 4.1.14 引物溶液:用 TE 缓冲液(4.1.7)或水分别将上述引物稀释到 10 mol/L。4.1.15 石蜡油石蜡油。4.1.16 PCR 产物回收试剂盒。4.1.17 DNA 提取试剂盒。4.2 仪器 4.2.1 分析天平:感量 0.1 g 和 0.1 mg。4.2.2 PCR 扩增仪:升降温速度1.5/s,孔间温度差异1.0。4.2.3 电泳槽、电泳仪等电泳装置。4.2.4 紫外透射仪。4.2.5 凝胶成像系统或照相系统。4.2.6 重蒸馏水发生器或纯水仪。4.2.7 其他相关仪器设备。4.3 分析步骤 4.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。4.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定的执行。4.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 规定的执行。4.3.5 PCR 反应 4.3.5.1 试样 PCR 反应 4.3.5.1.1 每个试样 PCR 反应设置 3 次重复。4.3.5.1.2 在 PCR 反应管中按表 2 依次加入反应试剂,混匀,再加 25 L 石蜡油(有热盖设备的 PCRDB12/T 5062014 4 仪可不加)。表 2 PCR 检测反应体系 试剂 终浓度 体积 水 10PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液(各 2.5 mmol/L)各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L 上游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L 10 mol/L 下游引物 0.10.5 mol/L 0.251.25 L Taq 酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 根据 Taq 酶的浓度确定其体积,并相应调整水的体积,使反应体系总体积达到 25.0 L。如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁,则不加氯化镁溶液,加等体积水。注 1:大豆内标准基因 PCR 检测反应体系中,上下游引物分别为 lec-1672F 和 lec-1672R,引物终浓度分别为 0.2mol/L;CaMV35S 启动子 PCR 检测反应体系中,上下游引物分别是 35S-F 和 35S-R,引物终浓度分别为0.4mol/L;NOS终止子PCR检测反应体系中,上下游引物分别是NOS-F和NOS-R,引物终浓度分别为0.4mol/L;CP4-epsps基因PCR检测反应体系中,上下游引物分别是mCP4ES-F和mCP4ES-R,引物终浓度分别为0.2mol/L;Bt 基因 PCR 检测反应体系中,上下游引物分别是 Bt-F 和 Bt-R,引物终浓度分别为 0.5mol/L;bar 基因和 pat基因复合 PCR 检测反应体系中,上游引物分别是 bar-F 和 pat-F,下游引物分别是 bar-R 和 pat-R,引物终浓度分别为 0.1mol/L。4.3.5.1.3 将 PCR 管放在离心机上,500 g3 000 g 离心 10 s,然后取出 PCR 管,放入 PCR 扩增仪中。4.3.5.1.4 进行 PCR 反应。反应程序按表 3 进行。表 3 PCR 反应程序 基因名称 变性 扩增 循环次数 最终延伸 Lectin 94,5 min 94,30 s 58,30 s 72,30 s 35 72,7 min CaMV35S 94,5 min 94,30 s 60,30 s 72,30 s 35 72,7 min NOS 94,5 min 94,30 s 60,30 s 72,30 s 35 72,7 min CP4-epsps 95,7 min 94,30 s 63,30 s 72,30 s 5 72,7 min DB12/T 5062014 5 94,30 s 60,30 s 72,30 s 3

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