DB52T 594-2010 甘薯脱毒试管苗生产技术规程.pdf

ICS 65.020.20B 05DB52贵 州 省 地 方 标 准DB 52/T5942010甘薯脱毒试管苗生产技术规程 2010-06-24 发布 2010-07-24 实施贵州省质量技术监督局 发 布IDB 52/T 5942010目 次 目 次.I前 言.11 范围.22 规范性引用文件.23 术语和定义.24 产地环境.25 生产技术.26 病虫害防治.57 采收.58 生产档案.61DB 52/T 5942010前 言本标准根据GB/T 1.1-2009 标准化工作导则第 1部分标准的编写与规则 给出的要求起草。本标准由贵州省农业委员会提出并归口。本标准的主要起草单位是贵州省生物技术研究所。本标准主要起草人：黄萍、颜谦、丁映、雷尊国、范士杰。2DB 52/T 5942010甘薯脱毒试管苗生产技术规程1 范围本标准规定了甘薯脱毒试管苗的定义，甘薯脱毒试管苗的生产、扩繁和病毒检测等技术要求。本标准适用于贵州省甘薯脱毒试管苗的繁育生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 402-2000 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 NY/T 1200-2006 甘薯脱毒种薯3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1甘薯脱毒试管苗sweet potato virus-free plantlet 通过对甘薯外植体进行茎尖剥离、培养而获得的不带甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯潜隐病毒(SPLV)、甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)的甘薯组培瓶苗。3.2外植体explant用于植物组织培养的带生长点的甘薯藤蔓茎段。3.3培养基medium 是一种人工配制的、适合培养材料生长繁殖的混合养料。主要由一定比例的无机盐、有机物、蔗糖、植物生长调节剂组成，其中不加凝固剂呈液态的培养基质称为液体培养基，加入凝固剂后呈固态的培养基质为固体培养基。3.4 消毒disinfection 是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分有害的病原菌，而对被消毒物体基本无害的措施。3.5 灭菌sterilization 采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，3DB 52/T 5942010如各种高温灭菌技术措施等。3.6原原种pre-elite用脱毒试管苗在容器内生产出的微型薯或在防虫网室、温室条件 F 生产的符合质量标准的微型薯。4 脱毒试管苗的生产4.1 培养材料选择 选择田间生长势强、健壮、具有被选品种典型特征的植株材料进行脱毒。4.2 外植体选择 选择无病虫、品种纯正的健壮植株，切取带生长点的茎段 2.0cm3.0cm，去掉叶片，用自来水冲洗干净。4.3 茎尖剥离4.3.1 将表面冲洗干净的外植体置于超净工作台上，先用 70%的酒精表面消毒 10s，再用2%的次氯酸钠溶液消毒 10 min15 min 后，无菌水冲洗 3 次5 次，置于无菌滤纸上吸去水分。4.3.2 将消毒好的外植体置于超净工作台上的双目解剖镜下，用解剖针轻轻剥去外植体上的未展开小叶至露出茎尖生长点，在仅留两个叶原基（大小约 0.2 mm0.4 mm）处用解剖刀小心地将其切下，茎尖向上、切面向下置于试管或三角瓶内的茎尖诱导培养基（配制方法见附录A）中，封口、编号。4.4 茎尖组织培养 将甘薯茎尖培养在温度 23 28，光照强度 2000 Lx3000 Lx，每日光照 12 h16h，相对湿度 70%80%的光照培养箱或培养室内培养。4.5 试管苗获得及增殖培养 甘薯茎尖诱导培养 24 个月，茎尖生长分化即可形成具有 23 片展开叶的试管苗，将其转接到固体增殖培养基（配制方法见附录 A）内培养，培养条件是 22 28，2000Lx3000 Lx，光照时间12h/d。4.6 试管苗的病毒检测 甘薯脱毒苗的检测按NY/T 1200 的 6.1执行。4.7 脱毒试管苗的试种鉴定 按 NY/T 1200 中的 6.1.3 执行，将部分检测合格的脱毒株系种植于防虫网棚内，对照原品种的特征特性，淘汰变异株，非变异株系用作扩繁。5 脱毒试管苗的扩繁4DB 52/T 5942010经试种证明未发生变异的脱毒试管苗株系可用于扩繁。5.1 试管苗的转接 在超净工作台上，将培养 30 d40 d 已形成 58 片展开叶的甘薯脱毒试管苗进行切段，每段留 12 片叶，叶面朝上插在固体增殖培养基（配制方法见附录 A）上，置于培养室或培养箱内培养。5.2 脱毒试管苗增值培养条件 培养室（培养箱）温度为 22 28，光照强度为 2000 Lx3000 Lx，每日光照 12 h16 h，相对湿度 70%80%。6 扩繁苗的病毒检测6.1 抽样 按NY/T 402 中的 4.1.1，4.1.2 执行。6.2 病毒检测 按 NY/T 1200 中的 6.2.1.2 进行甘薯病毒检测，检测的病毒类型是甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯潜隐病毒(SPLV)、甘薯褪绿斑病毒(SPCFV)。7 原原种的生产 选择苗龄在30 d50 d，具 58片叶、株高 5 cm8 cm、带 25条根的甘薯脱毒试管苗用于网棚移栽，生产原原种。5DB 52/T 5942010附录 A（资料性附录）培养基配制方法A.1 仪器和设备 A.1.1 高压灭菌锅A.1.2 冰箱A.1.3 烘箱A.1.4 双目实体解剖镜A.1.5 天平A.1.6 酸度计或pH试纸A.1.7 加热器A.1.8 不锈钢锅A.1.9 量筒、移液管A.1.10 烧杯、玻璃棒和滴管A.1.11 试管、三角瓶、培养瓶、耐高温封口材料或瓶盖A.1.12 手术剪、手术刀、解剖针、镊子A.2 试剂A.2.1 茎尖组织培养所用试剂为分析纯级别，培养基用水为蒸馏水；试管苗增殖阶段所用试剂为分析或化学纯级别，水为自来水。A.2.2 MS 培养基母液成分及含量(mg/L):a)大量元素：硝酸钾(KN03)1900，硝酸铵(NH4N03)1650，硫酸镁(MgS04)370，磷酸二氢钾(KH2P04)170，氯化钙(CaC122H20)440 b)微量元素：硫酸锰(MnS044H20)22.3，硫酸锌(ZnS047 H20)8.6，硼酸(H3803)6.2，碘 化 钾(KI)0.83，钼 酸 钠(Na2M0042H20)0.25，硫 酸 铜(CuS045H20)0.025，氯 化 钴(CoC126H20)0.025 c)铁盐：己二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）37.3，硫酸亚铁(FeS047H20)27.8 d)有机物：甘氨酸 2.0，盐酸硫胺素(VBl)0.4，盐酸吡哆醇(VB6)0.5，烟酸 0.5，肌醇100A.2.3 酒精、次氯酸钠(NaClO)、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)、6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、赤霉素(GA3)A.2.4 蔗糖、白糖、琼脂A.3 培养基类型A.3.1 茎尖诱导培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+GA3 0.05mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂6-9g/LA.3.2 固体增殖培养基：MS+白糖 30g/L+琼脂 6-9g/LA.4 培养及配制操作步骤A.4.1MS 培养基母液配制A.4.2 配制MS培养基母液使用的水质为蒸馏水、重蒸馏水或无离子水A.4.3 大量元素母液配制：按 100 倍的用量分别称取各大量元素，先单独定溶配制成母液。每升培养基取各种母液10ml。A.4.4 微量元素母液配制：按100倍的用量分别称取各微量元素，单独溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。A.4.5 铁盐配制：按 100 倍用量分别称取两种试剂，单独加热煮沸、再混合，混合后的溶液继续加热使之充分螯合，冷却后定溶备用。每升培养基用铁盐母液 10ml。6DB 52/T 5942010A.4.6 有机物配制：以 100 倍用量分别称量分别溶解，再混合、定溶。每升培养基取此母液10ml。A.4.7 植物激素配制A.4.8 萘乙酸 NAA 配制：按 0.1mg/ml 浓度适量称取萘乙酸 NAA，先用少许 95%酒精使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4 冰箱贮藏待用。A.4.9 赤霉素 GA3 配制：按 0.05mg/ml 浓度适量称取赤霉素 GA3，先用少许 95%酒精使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4冰箱贮藏待用。A.4.10 6-苄氨基腺嘌呤 6-BA 配制：按 0.5 mg/ml 浓度适量称取 6-苄氨基腺嘌呤 6-BA.用少许1N HC1 使之溶解，再用蒸馏水定溶，置于4 冰箱贮藏待用。A.4.11 MS 培养基配制方法：a)溶化琼脂：按需量称取琼脂入不锈钢锅内，加入所需配制培养基体积一半的水，加热溶化琼脂备用。b)加母液：将称量好的各种母液、糖加到溶解好的琼脂液中，继续加热并搅拌，待糖溶解，加水至所需配制培养基体积，搅拌均匀。c)调 pH 值：用酸度计或精密 pH 试纸测量所配制培养基的 pH 值，加 0.1N HC1 或NaOH 溶液调节培养基pH 值在 5.8-6.0之间。d)分装：趁热将培养基分装于试管、三角瓶或培养瓶内（不要将培养基粘附到培养瓶口），用耐高温高压材料封口，待灭菌。e)高压灭菌：用饱和蒸汽彻底排出高压灭菌锅内空气后，加热至 121，湿热灭菌 20min40 min（灭菌物体积越大，所需灭菌时间延长）后断电，待灭菌锅气压降至常压后，将培养基移到洁净室，备用。