DB51T 2910-2022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程.pdf

ICS 65.150 CCS B 52 四川省地方标准 DB51 DB51/T 29102022 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程 Technical specification for the diagnosis of Plesiomonas shigelloides for sturgeon 2022-05-20 发布 2022-07-01 实施 四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 2910-2022 I 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 试剂和材料.1 5 设备与器械.2 6 临床检查.2 7 实验室样品采集.2 8 细菌分离与纯化.2 9 细菌鉴定.2 10 结果判定.4 11 综合判定.4 附录 A（规范性）试剂配方.5 附录 B（资料性）类志贺邻单胞菌 16S rRNA 基因参考序列.6 DB51/T 2910-2022 II 前言 文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由四川省农业农村厅提出、归口并解释。本文件起草单位：四川省农业科学院水产研究所。本文件主要起草人：刘亚、龚全、赖见生、吴晓雲、陈叶雨、宋明江、杜军、刘光迅、周剑。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：本次为首次发布。DB51/T 29102022 1 鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断技术规程 1 范围 本文件规定了鲟鱼类志贺邻单胞菌病诊断的术语和定义、试剂和材料、设备和器材、临床检查、实验室样品采集、细菌分离与纯化、细菌鉴定、结果判定和综合判定等技术规程。本文件适用于达氏鲟（Acipenser dabryanus）和西伯利亚鲟（Acipenser baerii）的类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）的诊断。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 18652-2002 致病性嗜水气单胞菌检验方法 SC/T 7013-2008 水生动物产地检疫采样技术规范 SC/T 7014-2006 水生动物检疫实验技术规范 SC/T 7201.1-2006 鱼类细菌病检疫技术规程 第 1 部分：通用技术 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 鲟鱼类志贺邻单胞菌病 Plesiomonas shigelloides for sturgeon 指由类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigelloides）感染引起达氏鲟和西伯利亚鲟发病或死亡的一种细菌性疾病。4 试剂和材料 4.1 试剂、染色液和培养基 检验中所需试剂、染色液与培养基的配制按照 GB/T 4789.28、GB/T 18652 和 SC/T 7014 规定执行，Taq酶、dNTPs、10PCR缓冲液（无Mg2+），DNA分子量标准参照物选用专业试剂公司提供的商品化试剂；微生物生化鉴定管可替代相应鉴定培养基或鉴定试剂，上述未提及的见附录A。4.2 水 应符合GB/T 6682中一级水的规格。4.3 引物 16S rRNA 基 因 DNA 序 列 扩 增 引 物，P-F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，P-R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，-20 保存。DB51/T 29102022 2 5 设备与器械 超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、高速冷冻离心机、水平电泳系统、凝胶成像系统、普通光学显微镜、PCR扩增仪、电子天平、微量移液器、普通冰箱、解剖盘、剪刀、镊子、手术刀、培养皿、铂耳丝、酒精灯等。6 临床检查 6.1 临床症状 病鱼共同特征为反应迟钝，离群独游，游动迟缓或侧翻，摄食减少或停止摄食。6.2 体表检查 体表外部检查参照 SC/T 7201.1 中 6.2 执行。病鱼鳍条基部不同程度的充血、出血；部分病鱼腹部膨大；极少病鱼无明显外部病变。6.3 剖检 肝脏肿大充血，出血；部分病鱼肠道肠腔内有少量淡黄色的粘液，部分病鱼肠道无明显的变化。7 实验室样品采集 样品采集按 SC/T 7013 执行。8 细菌分离与纯化 在无菌的环境中，用灭菌铂耳分别勾取病鱼的肝、肾，划线接种至LB固体培养基，28 培育24-48小时，从中挑取圆形、隆起、光滑、边缘整齐的单个菌落在LB平板上进行纯化培养。LB培养基的配制方法见附录A.1。9 细菌鉴定 9.1 革兰氏染色 参考 GB/T 18652-2002 中 2.2.5 规定执行。9.2 生理生化试验 采用细菌生化鉴定管进行试验，也可利用全自动细菌鉴定仪鉴定。9.2.1 乙酰甲基甲醇（V-P）试验 按 SC/T 7014 中表 2 的规定执行。有气泡产生为阳性；无气泡产生为阴性。9.2.2 氧化酶试验 以毛细管吸取四甲基对二苯胺的 1%水溶液滴在细菌的菌落上。菌落呈玫瑰红色、深紫色为阳性，不变色为阴性。DB51/T 29102022 3 9.2.3 吲哚试验 按 SC/T 7014 表 2 的吲哚（靛基质）试验的规定执行。培养基变红为阳性；不变红为阴性。9.2.4 糖、醇类（葡萄糖、甘露醇）发酵试验 将待检菌穿刺接种于糖、醇类发酵试验培养基（A.2），28 培养 24 h后观察。培养基变黄色为阳性，不变黄色为阴性。9.2.5 运动性试验 按 GB/T 4789.28 中 2.8 的方法配制半固体培养基。把待检菌穿刺接种于半固体培养基，28 培养 36 h-48 h。若待检菌由穿刺线向四周扩散，其边缘呈云雾状，为运动性阳性；若待检菌只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，为运动性阴性。9.3 16S rRNA 基因序列测定与同源性分析 9.3.1 细菌基因组 DNA 抽提 酚氯仿法、高盐法或采用商用试剂盒提取细菌基因组DNA。9.3.2 16S rRNA 基因扩增 PCR反应体系：10 PCR缓冲液（无Mg2+）5.0 L，MgCl2（25 mmol/L）5.0 L，dNTPs（10 mmol/L）1.0 L，引物(20 mol/L)P-F和P-R各1.0 L，Taq DNA酶（5 U/L）0.5 L，DNA模板1.0 L，无菌双蒸水补足至50 L。混匀后，3000 r/min离心30s。设空白对照，空白对照取等体积的双蒸水代替DNA模板。PCR反应条件：94 预变性 5 min；94 变性 1 min，54 退火 1 min，72 延伸 1 min，35次循环；72 延伸 10 min；4 保温。9.3.3 琼脂糖凝胶电泳 用TAE电泳缓冲液（A.3）配制 1 的琼脂糖平板，凝固后放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将上述 6 L样品和 2 L溴酚蓝指示剂溶液（A.4）混合后加入样品孔，使用DNA分子量标准参照物作对照。120 V电泳约 20 min-40 min，当溴酚蓝到达底部时停止。于紫外光下观察，并在长波紫外灯下用刀片切下含目的条带（约1500 bp）的胶块，放入无菌离心管中称重。9.3.4 PCR 扩增产物纯化、测序、序列比对 9.3.4.1 PCR 扩增产物纯化 按每 0.1 g 琼脂糖凝胶加 0.1 mL 酚，将酚加入 9.3.3 含有目的条带胶块的离心管中。经漩涡震荡仪震荡1 min-2 min，将离心管在-70 放置1h，使凝胶完全冻结。37 水浴将冻结的凝胶融化后，在漩涡震荡仪上震荡 1 min-2 min；14000 r/min 离心 5 min。取上层水相转入另一个离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25241）（A.5），混匀，12000 r/min 离心 5 min。取上清液加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）（A.6），混匀，12000 r/min 离心 5 min。向收集的水溶液中加入 1/10 体积的 3 mol/L 的乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，置-20 过夜或-70 放置 1 h-2 h。14000 r/min 离心 10 min，弃上清。将沉淀的DNA溶于适当体积的TE缓冲液中，置-20 保存，待测。9.3.4.2 PCR 扩增产物测序与同源性分析 将上述纯化的PCR扩增产物进行序列测定，并与参考序列（附录B）进行比对分析。DB51/T 29102022 4 10 结果判定 10.1 菌落形态 28 培养 24 h-48 h，形成圆形、隆起、光滑、边缘整齐的菌落。10.2 细菌染色 革兰氏染色为阴性短杆菌。10.3 生理生化试验 生理生化反应试验结果见表 1。表 1 类志贺邻单胞菌的生理生化反应结果 反应项目 结果 反应项目 结果 反应项目 结果 氧化酶+甘露醇-V-P-吲哚+葡萄糖+运动性+注：“+”为阳性，“-”为阴性 10.4 16S rRNA 基因序列测定与同源性分析 测定的 16S rRNA基因序列与附录B所列的基因序列比较，同源性达 98%以上。11 综合判定 符合以下所有特征者判定为类志贺邻单胞菌病 a)临床症状与 6 相符；b)菌落形态和染色观察与 10.1 和 10.2 相符；c)生理生化反应结果与 10.3 相符；d)16S rRNA 基因序列同源性分析结果与 10.4 相符。DB51/T 29102022 5 附 录 A（规范性）试剂配方 A.1 LB 固体培养基 胰蛋白胨 10 g 酵母提取物 5 g NaCl 5 g 琼脂或者琼脂糖 15 g 蒸馏水 1000 mL pH 7.0-7.2，115 灭菌 20 min。A.2 糖、醇类发酵培养基 蛋白胨 2 g NaCl 5 g K2HPO4 0.2 g 被测糖或醇类 10 g 琼脂 6g 溴百里酚蓝 1 水溶液 3 mL（溴百里酚蓝先用少量 95 乙醇溶解后，再加水配制 1 的水溶液）蒸馏水 1000 mL pH 7.0-7.2，分装试管，培养基高度约 4.5 cm，115 灭菌 20 min。A.3 50TAE 电泳缓冲液 在 800 mL双蒸水中溶解 242 g Tris碱，加入57.1 mL冰乙酸和 37.2 g EDTA，充分混匀后，加双蒸水定容至 1 L，室温保存。使用时，配成1TAE电泳缓冲液。A.4 溴酚蓝指示剂溶液 6上样缓冲液 将溴酚蓝 100 mg，加双蒸水 5 mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖 25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL，加入NaOH溶液 1 滴，调至蓝色。A.5 酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）将 25 体积的酚、24 体积的氯仿和 1 体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中，上面加上TE缓冲液，4保存。A.6 氯仿：异戊醇（24:1）将 24 体积的氯仿和 1 体积的异戊醇混合即可，室温贮存于不透光的瓶中。DB51/T 29102022 6 附 录 B（资料性）类志贺邻单胞菌16S rRNA基因参考序列 AAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGGGATTCGCTCACTATCGCTAGCTTGCCGCCCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCGAATCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTG