SNT 3824-2014 化妆品光毒性试验 联合红细胞测定法.pdf

SN/T3824-2014白。因此，血红蛋白氧化也称高铁血红蛋白形成(methaemoglobin information,MetHb information),血红蛋白氧化值也称高铁血红蛋白形成值，可以通过用Triton X-l00溶解剩余细胞并测定其630nm处的光密度值来得到。3.6Hso 50%haemolysisH0指的是50%溶血值，能使红细胞出现50%溶血的被试物质的浓度。3.7F(+/-)haemolysis factorF(+/一)指的是溶血因子，可以预测被试物质光毒性潜能，等于避光板和光照板的H0之比。3.8DOD delta OD(max)表示高铁血红蛋白的最大形成值，可以预测被试物质的光毒性潜能。4方法原理在有光毒性物质存在时，红细胞受辐照后可以造成血红蛋白氧化（形成高铁血红蛋白）和红细胞溶解。化合物的光毒性潜力可以通过测定该化合物在紫外光(UV)和可见光（太阳光）照射下对红细胞膜损伤和/或氧化血红蛋白（蛋白质相关的光损伤）的能力来评价。其中，红细胞溶解程度可以通过测定释放到上清液中的血红蛋白量来确定，即540m处的光密度值；血红蛋白氧化可以发生在溶解后的细胞外，也可以发生在细胞内，总的血红蛋白氧化能力（高铁血红蛋白形成值）可以通过用Triton X-100溶解剩余细胞并测定其630nm处的光密度值来得到。5主要设备5.1酶标仪（波长范围400nm750nm)。5.2光源（太阳光模拟器，配备500W的金属卤化物灯和305nm的H2灯栅，如S0L500,Honle,Mu-nich,Germany)。5.3辐照计（光照强度UVA=1.67mW/cm2,UVB=0.1MW/cm2;照射150min后，UVA剂量=l5J/cm2,UVB剂量=1J/cm2,如Honle,Munich,Germany)。5.4离心管(10mL)。5.524孔细胞培养板(Nunc)。5.6微量板离心机。5.7微量可调移液器(2L、10uL、100L、1000L)及相应的吸头。6试验准备6.1红细胞的制备：采集人或者其他哺乳动物（如犊牛、猪、绵羊和兔子）的抗凝血100mL,洗涤3次，以去除血浆和白细胞层。用PBS(配制见附录A.1)制备40%的细胞悬液，每100mL血液可以制得5份10mL的红细胞悬液，每份红细胞悬液足够10块24孔细胞培养板的用量，4保存备用（最多可以保存1周)。试验之前，1份红细胞悬液用PBS调整至ODs5m2.0为止。6.2阳性对照：阳性对照为氯丙嗪，浓度范围从1mg/L300mg/L,在光照板和避光板都可以出现溶血，但前者的溶血程度强于后者。6.3阴性对照：阴性对照为SDS,浓度范围从1mg/L100mg/L,在光照板和避光板上的溶血程度和2