DB15T 1847-2020 黄羊源性成分检测 实时荧光PCR法.pdf

ICS 67.120.01 B 45 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 18472020 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR Method for Detection of Procapra Gutturosa-Derived Materials 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 18472020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国二连海关。本标准主要起草人：王伊琴、陈少博、包勇敢、杨帆、寇福军、张志峰、荆文魁、常鸿。DB15/T 18472020 1 黄羊源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了动物源性产品中黄羊源性成分实时荧光PCR检测方法。本标准适用于动物源性产品（肉制品、皮毛类产品、饲料等）中黄羊源性成分的鉴定，灵敏度为0.001ng/L。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB/T 5009.1 食品卫生检验方法 理化部分 总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。3.1 CTAB 十六烷基三甲基溴化铵。3.2 EDTA 乙二胺四乙酸。3.3 Realtime PCR 实时荧光定量聚合酶链式反应。3.4 Tris-HCl 三氨基甲烷。4 设备 4.1 实时荧光 PCR 检测系统。4.2 高速台式冷冻离心机（最高转速 12000 rpm 以上）。4.3 离心机。4.4 旋涡振荡器。DB15/T 18472020 2 4.5 单孔道微量移液器和枪头：0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200 L、100 L1000 L。4.6 EP 离心管。4.7 刻度量筒：100 mL，500 mL，1000 mL。4.8 试剂瓶和洗涤瓶：500 mL。4.9 天平。5 试剂与材料 5.1 水：符合 GB/T6682 分析实验室二级水规格。5.2 试剂盒：按说明书使用试剂盒提供的相应试剂。5.3 自备的试剂：CTAB 提取缓冲液（十六烷基三甲基溴化铵），CTAB-沉淀液，蛋白酶 K（1.2 mol/L）氯化钠。5.4 实时荧光预混液。5.5 引物对序列-上游：5-CTAGGCAACATGCATATC-3-下游：5-CGAGAAGAGAAATCCTTG-3-探针序列：5-FAM-CACGAGCTTAATGACCATGCCG-TAMRA-3 5.6 质控物质 5.6.1 阳性对照样品：采用已知含有黄羊源性成分的样品或经测序确认的阳性质粒。5.6.2 阴性对照样品：采用已知不含有黄羊源性成分的样品。5.6.3 空白对照：采用与模板等体积的双蒸水。6 实验方法 6.1 样品的选取与制备 动物源性食品按照 GB/T 5009.1 和 GB 4789.1 采样。将实验室样品研磨待用。6.2 样品 DNA 的提取 参照附录A中方法提取样品基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA提取试剂盒进行。当A260/A280比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。除检测样品外，需要设立阴性、阳性及空白对照。6.3 实时荧光 PCR 检测 6.3.1 反应体系 反应体系体积为25 L，体系组成见表1。DB15/T 18472020 3 表1 黄羊源性成分实时荧光PCR检测方法的反应体系 试剂名称 贮备液浓度 mol/L 反应体系体积 L PCR 反应预混合液 12.5 上游引物（F）10 1 下游引物（R）10 1 探针（P）10 1 模板 2 双蒸水 补足至总体积为 25 6.3.2 反应条件 预变性：94，10 min；变性：94，15 s；延伸退火：58，1 min，40 个循环。在 58 时收集荧光信号值。6.3.3 检测过程 分别设阴性对照、阳性对照和空白对照。7 结果判定与表述 7.1 质量控制 7.1.1 一般要求 实验中设置的各种对照PCR检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做试验。7.1.2 核酸提取空白对照和 PCR 扩增试剂空白对照 检测结果Ct40.0 7.1.3 PCR 扩增阴性目标 DNA 对照 检测结果Ct40.0 7.1.4 PCR 扩增阳性目标 DNA 对照 检测结果Ct35.0 7.2 结果判断和报告 7.2.1 样品 2 个平行样检测结果 Ct40.0，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品结果为阴性，报告未检出黄羊源性成分。7.2.2 样品至少 1 个平行样检测结果 35.0Ct40.0，并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。再次检测结果仍然 Ct40.0 并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分；再次检测结果仍然 Ct40.0 同时各种试验对照结果正常，可以判断样品未检出黄羊源性成分，报告未检出黄羊源性成分。DB15/T 18472020 4 7.2.3 样品 2 个平行样品检测结果 Ct35.0 并出现典型的扩增曲线，同时各种试验对照结果正常，可以判断样品检出黄羊源性成分，报告检出黄羊源性成分。8 防止交叉污染措施 按照GB/T 19495.2 防止检测过程中交叉污染。DB15/T 18472020 5 A A 附 录 A（资料性附录）样品 DNA 的提取及溶液配制 A.1 CTAB-提取缓冲液 将5 g CTAB，20.45 g NaCL，3.03 g Tris，1.86 g Na2-EDTA溶于200 mL水中，用盐酸调pH 8.0后，定容至250 mL，115 高压15 min。A.2 CTAB-沉淀液 称0.2 g CTAB，0.234 g NaCL，定容至100 mL，115 高压15 min。A.3 蛋白酶K 按试剂说明配制。A.4 1.2 mol/L NaCL溶液 称取28 g NaCL，定容至400 mL，115 高压15 min。A.5 DNA提取方法 A.5.1 称取样品0.5 g1 g加入1.5 mL3.5 mL CTAB提取液中，再加入12 L20 L蛋白酶K（根据CTAB量调节），每个样品提取2管，同时用水做空白对照。混匀后65 至少1 h(过夜孵育最好)，如样品膨胀，则可再多加CTAB，每次多1 mL，最多10 mL。A.5.2 低温4000 rpm5000 rpm离心10 min。A.5.3 将上清（约1 mL）加入无菌EP中（2 mL管），加入700 L氯仿，旋涡30 s后，再12000 rpm离心10 min。A.5.4 取上清600 L650 L加入无菌EP中，加入2倍体积的CTAB沉淀液，旋涡混匀，室温静置1 min。A.5.5 12000 rpm离心10 min，去上清。沉淀溶解于350 L的1.2 mol/L NaCL溶液。（2管合并共用350 L溶液）。A.5.6 加入350 L氯仿，涡旋30 s，再12000 rpm离心10 min。A.5.7 取上清液至无菌EP管中（确定体积），加入0.8倍体积的异丙醇，手摇混匀，室温孵化至少20 min,12000 rpm离心10 min，去上清，沉淀用500 L 75%的乙醇洗涤，再12000 rpm离心10 min。A.5.8 去上清后，干燥沉淀，60 下15 s20 s（开盖倒立）。A.5.9 将沉淀溶于100 L灭菌水或TE Buffer或DEPC水中。B DB15/T 18472020 6 附 录 B（资料性附录）黄羊源性成分的目标扩增序列大小 94bp CTAGGCAACATGCATATCCCGTCCCCTAGATCACGAGCTTAATGACCATGCCGCGTGAAACCAACAACCCGCTCGGCAAGGATTTCTCTTCTCG _