DB15T 1848-2020 动物垫料中沙门氏菌检测.pdf

ICS 07.100.99 B 41 DB15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 18482020 动物垫料中沙门氏菌检测 Detection for salmonella in animal bedding 2020-02-25 发布 2020-03-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 18482020 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院。本标准主要起草人：赵治国、崔强、王海艳、于志超、陈林军、延涵、任彩霞、潘国卿、姚利宏、陈少博、罗晓平、李军燕。DB15/T 18482020 1 动物垫料中沙门氏菌检测 1 范围 本标准规定了动物垫料中沙门氏菌的分离鉴定定性检测法。本标准适用于动物垫料中沙门氏菌定性检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第 1 部分：实验室培养基制备质量保证通则 SN/T 1538.2 培养基制备指南 第 2 部分：培养基性能测试实用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 动物垫料 animal bedding 用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。4 设备和材料 4.1 冰箱：2 5。4.2 恒温培养箱：36 1，42 1。4.3 均质器。4.4 漩涡振荡器。4.5 电子天平：感量0.1 g，0.0001 g 4.6 全自动微生物生化鉴定系统。4.7 飞行时间质谱仪。4.8 二级生物安全柜。4.9 pH 计。4.10 微量移液器。4.11 无菌锥形瓶：容量500 mL，250 mL。DB15/T 18482020 2 4.12 无菌吸管：1 mL(具0.01 mL刻度)、10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。4.13 无菌培养皿：15 mm90 mm。4.14 无菌试管：18 mm180 mm。4.15 无菌棉签。4.16 无菌镊子。4.17 无菌剪刀。4.18 无菌勺。4.19 无菌玻片。4.20 无菌接种环。5 培养基和试剂 5.1 实验用水：符合GB/T 6682的要求。5.2 缓冲蛋白胨水(BPW)：见附录A.2。5.3 MkTTn肉汤：见附录A.3。5.4 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液：见附录A.4。5.5 亚硫酸铋(BS)琼脂：见附录A.5。5.6 HE琼脂：见附录A.6。5.7 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂：见附录A.7。5.5 沙门氏菌属显色培养基。5.9 三糖铁(TSI)琼脂：见附录A.8。5.10 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A.9。5.11 尿素琼脂(pH7.2)：见附录A.10。5.12 氰化钾(KCN)培养基：见附录A.11。5.13 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A.12。5.14 糖发酵管：见附录A.13。5.15 邻硝基酚-D半乳糖苷(ONPG)培养基：见附录A.14。5.16 半固体琼脂：见附录A.15。5.17 丙二酸钠培养基：见附录A.16。5.18 无菌生理盐水：见附录A.17。5.19 生化鉴定试剂盒。5.20 革兰氏染液。5.21 革兰氏阴性菌生化鉴定卡。5.22 飞行质谱仪靶板。5.23 沙门氏菌标准菌株 ATCC 13311或等效菌株。5.24 大肠杆菌标准菌株 CMCC 44102或等效菌株。5.25 产气肠杆菌标准菌株 ATCC 13048或等效菌株。6 检验程序 沙门氏菌检验程序见图 1。DB15/T 18482020 3 36 1，16 h20 h 36 1，24 h2 h 361，18 h24 h 36 1，40 h48 h 36 1，18 h24 h 图1 沙门氏菌检验程序 7 操作步骤 7.1 采样 样品制备 检样 25g 或 25cm2样液+225mL BPW 预增菌 1mL+10mL MkTTn 1mL+10mL SC BS 琼脂平板 XLD（或 HE、显色培养基）挑取纯培养后的可疑菌落 生化鉴定和/或全自动检测设备鉴定 沙门氏菌 非沙门氏菌 血清学鉴定 报 告 DB15/T 18482020 4 7.1.1 采样原则 样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。7.1.2 颗粒状或粉末样品 对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少 250 g，充分混匀后称取 25 g 颗粒状或粉末状垫料样品，加入 225 mL BPW，充分振摇或均质 1 min2 min，置 36 1 培养 16 h20 h，进行预增菌。7.1.3 平面样品 无菌操作将灭菌规格板（5 cm5 cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格 3 次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有 25 mL 无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复取样 14 个规格板面积，相应地将棉拭子头置入 25 mL100 mL 的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1 mL 原液对应的样品面积为 1 cm2）。取 25 mL 样品原液加入 225 mL BPW，充分振摇或均质1 min2 min，置 36 1 培养 16 h20 h 进行预增菌。表1 不同面积平面类垫料样品采样量 样品面积 m2 采样量 cm2 规格板数 小于0.25（含）25 1 0.250.5（含）50 2 0.50.75（含）75 3 大于0.75 100 4 7.2 选择性增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL 转种于 10 mL MkTTn 肉汤内，于 36 1 培养 24 h2 h。同时，另取 1 mL 转种于 10 mL SC 增菌液中，于 36 1 培养 18 h24 h。7.3 分离培养 用直径3 mm的接种环取 MkTTn 肉汤和 SC 增菌液各1环，分别划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板(或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板)，于36 1 培养40 h48 h(BS 琼脂平板)或18 h24 h(XLD 琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板)，观察各个平板上生长的菌落，根据菌落形态初步判定典型和可疑菌落，沙门氏菌在各种选择性琼脂平板上的菌落特征见表2。根据菌落形态挑取5个典型或可疑菌落（少于5个时，全部挑取），分别划线接种于营养琼脂平皿进行分离纯化，36 1 培养18 h24 h。DB15/T 18482020 5 表2 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌菌落形态 BS琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基无变化。HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基 依据显色培养基的说明书判定。7.4 鉴定 7.4.1 染色镜检 沙门氏菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞,一般无荚膜，直径约为0.6 m1 m。7.4.2 生化鉴定 挑取纯培养的菌落进行沙门氏菌生化鉴定，具体操作依据沙门氏菌生化鉴定试剂说明书或见附录B。7.4.3 辅助设备鉴定 可根据实验室情况，选用全自动微生物生化鉴定系统或飞行时间质谱仪等对典型或可疑菌落进行鉴定，具体操作依据标准 GB/T 33682 和设备操作规范进行。7.4.4 血清学鉴定 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阳性的菌株，进行血清学鉴定。7.4.4.1 自凝性检查 先在洁净的玻片上滴加一滴生理盐水，挑取适当大小的纯菌落（用于纯培养的营养琼脂琼脂含量为1.2%1.5%）混合于生理盐水滴内，使其成为均一的混浊悬液（轻度乳浊），将玻片轻轻摇动1 min2 min，在黑色背景下观察反应，若出现可见白色的菌体凝集块，即为有自凝性，反之为无自凝性。对无自凝性的培养物进一步进行血清学鉴定。7.4.4.2 多价菌体抗原(O)鉴定 用 O 抗原进行鉴定，具体操作同7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2%3%）培养基上培养后再鉴定；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O抗原凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中制成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再鉴定。7.4.4.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定 操作同 7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。H 抗原发育不良时，将菌株接种在0.55%0.65%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，取其边缘菌进行鉴定。DB15/T 18482020 6 7.4.4.4 表面抗原（Vi）鉴定 用 Vi 抗原进行鉴定，具体操作同 7.4.4.1，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。已知具有 Vi 抗原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌和都柏林沙门氏菌。8 结果与报告 8.1 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阳性的菌株，同时血清学鉴定结果为阳性，报告动物垫料样品中检出沙门氏菌。8.2 沙门氏菌生化试验、全自动生化鉴定系统或飞行质谱仪鉴定为阴性的菌株，报告动物垫料样品中未检出沙门氏菌。9 生物安全措施 为了保护实验室人员安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置，应按照GB 19489的有关规定执行。10 废弃物处理和防治污染的措施 检测过程中的废弃物需经121 高压灭菌处理至少30 min后再弃置。DB15/T 18482020 7 A A 附 录 A（规范性附录）培养基和试剂 A.1 培养基制备及质量保证 按照SN/T 1538.1和SN/T 1538.2执行，并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效的脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2 缓冲蛋白胨水(BPW)A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 氯化钠 5.0 g 磷酸氢二钠(含12个结晶水)9.0 g 磷酸二氢钾 1.5 g 蒸馏水 1000 mL A.2.2 制法 将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10 min，煮沸溶解，调节pH至7.20.2，高压灭菌121，15 min。A.3 MkTTn肉汤 A.3.1 基础液 酪胨 8.6 g 牛肉粉 4.3 g 氯化钠 2.6 g 硫代硫酸钠 30.5 g 碳酸钙 38.7 g 牛胆盐 4.78 g 煌绿 0.0096 g 新生霉素 0.04 g 蒸馏水 1000 mL 除碳酸钙外，将各成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，再加入碳酸钙，调节pH至8.20.2，摇匀煮沸灭菌。DB15/T 18482020 8 A.3.2 硫代硫酸钠溶液 硫代硫酸钠(含5个结晶水)50.0 g 蒸馏水 加至100 mL 高压灭菌 121，20 min。A.3.3 0.5%煌绿水溶液 煌绿 0.5 g 蒸馏水 100 mL 溶解后，存放暗处，不少于1 d，使其自然灭菌。A.3.4 牛胆盐溶液 牛胆盐 10.0 g 蒸馏水 100 mL 加热煮沸至完全溶解，121 高压灭菌20 min。A.3.5 制法 基础液 900 mL 硫代硫酸钠溶液 100 mL 煌绿水溶液 2.0 mL 牛胆盐溶液 50.0 mL 临用前，按上列顺序，以无菌操作依次加入基础液中，每加入一种成分，均应摇匀后再加入另一种成分。A.4 亚