DB12T 652-2016 转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4及其衍生品 种定性检测实时荧光PCR法.pdf

ICS 67.050 B 23 天津市地方标准 DB12 DB12/T 6522016 转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种定性检测 实时荧光 PCR 法 Detection of genetically modified plants and derived products Qualitative PCR method for herbicide-resistant soybean DAS-68416-4 and its derivates 2016-09-27 发布 2016-11-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会发布天津市市场和质量监督管理委员会发布 DB12/T 6522016 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、李亮、赵新、刘雪岩、宛煜嵩、王成、陈锐、朱珠、刘娜、徐石勇。本标准 2016 年 9 月首次发布。DB12/T 6522016 1 转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种定性检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本标准规定了转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 转化体特异性的定性 PCR 检测方法的术语和定义、检测方法、结果分析与表述。本标准适用于转基因耐除草剂大豆 DAS-68416-4 及其衍生品种，以及制品中 DAS-68416-4 转化体成分的定性 PCR 检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 农业部 1485 号公告42010 转基因植物及其产品成分检测 DNA 提取和纯化 农业部 2031 号公告82013 转基因植物及其产品成分检测 大豆内标准基因定性 PCR 法 农业部 2031 号公告192013 转基因植物及其产品检测 抽样 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 农业部 2031 号公告82013 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1 Lectin 基因 Lectin gene 编码大豆凝集素的基因。3.2 DAS-68416-4 转化体特异性序列 event-specific sequence of DAS-68416-4 DAS-68416-4 外源插入片段 5端与大豆基因组的连接区序列。4 原理 根据转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性序列设计特异性引物，对试样DNA进行PCR扩增。依据是否扩增获得典型的实时荧光扩增曲线，判断样品中是否含有 DAS-68416-4 转化体成分。5 检测方法 5.1 试剂和材料 除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合 GB/T 6682 规定的一级水。5.1.1 TaqMan 荧光定量 PCR 反应试剂盒。5.1.2 引物和探针。DB12/T 6522016 2 5.1.2.1 Lectin 基因。lec-1215F：5-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3 lec-1332R：5-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3 lec-1269P：5-FAM-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-BHQ1-3 预期扩增片段大小为 118 bp（参见附录 A）。5.1.2.2 DAS-68416-4 转化体特异性序列。DAS-68416-4-F：5-GGGCCTAACTTTTGGTGTGATG-3 DAS-68416-4-R：5-TACTTGCTCTTGTCGTAAGTCAATAAATT-3 DAS-68416-4-P：5-HEX-TTCAAGCACCAGTCAGCAT-MGB-3 预期扩增片段大小为 128 bp（参见附录 A）。用水分别将上述引物和探针稀释到 10 mol/L。探针需避光保存。5.2 仪器 分析天平：（感量 0.1 g 和 0.1 mg）；荧光定量 PCR 扩增仪；核酸定量仪；重蒸馏水发生器或纯水仪；其他相关仪器设备。5.3 分析步骤 5.3.1 抽样 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定执行。5.3.2 试样准备 按 NY/T 672 和农业部 2031 号公告192013 规定执行。5.3.3 试样预处理 按农业部 1485 号公告42010 规定执行。5.3.4 DNA 模板制备 按农业部 1485 号公告42010 规定执行。5.3.5 PCR 反应 5.3.5.1 标准样品和试样实时荧光 PCR 反应 同时进行标准样品和试样的 PCR 反应，每个 PCR 反应设置 3 次平行。DAS-68416-4 转化体实时荧光 PCR 反应按表 1 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀；Lectin内标基因实时荧光 PCR 反应按表 2 在 PCR 反应管中依次加入反应试剂，混匀。将 PCR 管放在离心机上，500 g3 000 g 离心 10 s，然后取出 PCR 管，放入 PCR 仪中。运行实时荧光 PCR 反应。反应程序为：94变性 5 min；进行 45 次循环扩增反应（94变性 15 s，60退火延伸 1 min）；在第二阶段的退火延伸（60）时段收集荧光信号。（可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。）DB12/T 6522016 3 表 1 DAS-68416-4 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L DAS-68416-4-F 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L DAS-68416-4-R 0.8 mol/L 2.0 L 10 mol/L DAS-68416-4-P 0.4 mol/L 1.0 L DNA 模板 2.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。表 2 Lectin 内标基因 PCR 反应体系 试剂 终浓度 体积 TaqMan 反应缓冲液 1 10 mol/L lec-1215F 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L lec-1332R 0.2 mol/L 0.5 L 10 mol/L lec-1269P 0.2 mol/L 0.5 L DNA 模板 2.0 L 无菌水 总体积 25.0 L 根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。“”表示体积不确定。根据 TaqMan 反应液的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。5.3.5.2 设置对照 在试样 PCR 反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因大豆基因组DNA作为阴性对照；以耐除草剂大豆DAS-68416-4质量分数为0.1%1.0%的基因组 DNA（或采用大豆 DAS-68416-4 与非转基因大豆基因组相比的拷贝数分数为 0.1%1.0%的DNA 溶液）作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照 PCR 反应体系中，除模板外，其余组分及 PCR 反应条件与 5.3.5.1 相同。6 结果分析与表述 6.1 Lectin内标准基因无典型扩增曲线，表明样品中未检出大豆成分，结果表述为“样品中未检测出大豆成分，检测结果为阴性”。6.2 Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且Ct值38；同时DAS-68416-4转化体特异性序列出现典型扩增曲线，且Ct值38，表明样品中检测出DAS-68416-4转化体成分，结果表述为“样品中检测出转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体成分，检测结果为阳性”。DB12/T 6522016 4 6.3 Lectin内标准基因出现典型扩增曲线，且Ct值38；但DAS-68416-4转化体特异性序列未出现典型扩增曲线，表明样品中未检测出DAS-68416-4转化体成分，结果表述为“样品中未检测出转基因耐除草剂大豆DAS-68416-4 转化体成分，检测结果为阴性”。6.4 Lectin 内标准基因和/或 DAS-68416-4 转化体特异性序列出现典型扩增曲线，但 Ct 值在 3840之间，进行重复实验。如重复实验结果符合 6.16.3 的情形，依照 6.16.3 进行判断。如重复实验检测参数出现典型扩增曲线，但检测 Ct 值仍在 3840 之间，则判定样品检出 Lectin 内标准基因和/或转化体特异性序列，根据检出参数情况，参照 6.16.3 对样品进行判定。DB12/T 6522016 5 附录A（资料性附录）A.1 Lectin基因基因实时荧光实时荧光PCR扩增产物核苷酸扩增产物核苷酸序列序列（Accession No.K00821）1 GCCCTCTACT CCACCCCCAT CCACATTTGG GACAAAGAAA CCGGTAGCGT TGCCAGCTTC 61 GCCGCTTCCT TCAACTTCAC CTTCTATGCC CCTGACACAA AAAGGCTTGC AGATGGGC 注：划线部分为 lec-1215F 和 lec-1332R 引物序列，方框内为探针 lec-1269P 序列。A.2 耐除草剂大豆耐除草剂大豆DAS-68416-4转化体特异性转化体特异性序列序列 1 GGGCCTAACT TTTGGTGTGA TGATGCTGAC TGGTGCTTGA ATGATTTAAA AATAAATTTT 61 TAATTTAGTT GTAACAAGTT TTAAGTATTT TTTTATATTA ATTTATTGCA TTACGACAGA 121 AGCAAGTA 注 1：划线部分为 DAS-68416-4-F 和 DAS-68416-4-R 引物序列，方框内为探针 DAS-68416-4-P 序列。_