ICS11.220B43DB13河北省地方标准DB13/T2593—2017禽腺病毒4型PCR检测方法2017-11-22发布2017-12-22实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2593—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北农业大学提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、王建昌、孙继国、刘聚祥、李丽敏、陈立功、李睿文、张磊、白云、陈赛娟、李杰峰。DB13/T2593—20171禽腺病毒4型PCR检测方法1范围本标准规定了禽腺病毒4型PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测家禽咽喉拭子、肛拭子，发病禽组织和这些采集样品培养物中的禽腺病毒4型。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1DNA脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）2.2EB溴化乙锭（ethidiumbromide）2.3PCR聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）2.4dNTP脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）3试剂或材料包括各种市售病毒核酸提取试剂盒，1.0%琼脂糖凝胶，50×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，DNA分子量标准（100bp），2×TaqMasterMix或商品化的一步法PCR反应试剂。警示:电泳中用到的EB在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要进行无害化处理；DEPC在操作中应在通风条件下进行，使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。3.1病毒核酸提取试剂盒。3.21.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录A中A.1。3.350×TAE缓冲液，配制方法见附录A中A.2。3.4溴化乙锭（EB，10ug/μL）或核酸染料，配制方法见附录A中A.3。3.5焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌的双蒸水，配制方法见附录A中A.4。DB13/T2593—201723.6DNA分子量标准（100bp）:包含100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp几种分子量标准。3.72×TaqMasterMix。3.8商品化的一步法PCR反应试剂：含有PCR缓冲液、酶混合物、dNTP混合物、无RNA酶的水等。3.9引物：上游引物与下游引物见附录B中的表B.1。引物浓度为10μmol/L。4仪器设备4.1PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃；样品基座配置至少包括单个0.2mL孔。4.2凝胶成像系统：检测灵敏度DNA≥0.1ng；有效像数1360×1024、10bit、USB2.0。4.3台式低温高速离心机：最高转速16000r/min；容量1.5mL×12。4.4电泳仪：电压50V～120V，电流10mA～800mA，定时0min～999min。4.5电泳槽:耐高温、耐腐蚀、不漏液；缓冲液容量充足。4.6冰箱:具有冷藏功能。4.7微量移液器:单道可调；量程包括0.5～10μL、2...
