WST 493-2017 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南.pdf

书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国卫生行业标准犠犛犜 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南犌狌 犻 犱 犲狋 狅狋 犺 犲犲 狊 狋 犻 犿犪 狋 犻 狅 狀狅 犳狋 犺 犲犿犲 犪 狊 狌 狉 犲犿犲 狀 狋狌 狀 犮 犲 狉 狋 犪 犻 狀 狋 狔狅 犳狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犿犲 狋 犺 狅 犱 狊犻 狀犲 狀 狕 狔犿狅 犾 狅 犵 狔狉 犲 犳 犲 狉 犲 狀 犮 犲犾 犪 犫 狅 狉 犪 狋 狅 狉 犻 犲 狊 发布 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布书 书 书目次前言范围规范性引用文件术语和定义缩略语测量不确定度 误差和不确定度 不确定度的来源 不确定度的分类评定测量不确定度 评定测量不确定度的一般步骤 评定测量不确定度的过程评定测量不确定度的具体步骤 规定被测量 参考方法测量酶催化活性浓度的测量程序和测量模型 识别所有可能测量不确定度来源 绘制测量过程因果（鱼骨）图和测量全过程不确定度计算公式 列出每一输入量的量值 计算每一输入量的标准不确定度和绘制预估表 计算酶催化活性浓度量值（）评定测量全过程的合成标准不确定度 计算扩展不确定度（犝）并确定合成因子（犽）和单位 输入量对测量不确定度的贡献图和主要输入量 不确定度的报告 总则 所需要的信息 报告标准不确定度 报告扩展不确定度 与限值的符合性 附录（资料性附录）寻找测量不确定度的来源以及因果（鱼骨）图的绘制 附录（资料性附录）不确定度的常见来源和数值 附录（资料性附录）数据分布函数 犠犛犜 前言本标准按照 给出的规则起草。本标准起草单位：北京医院、北京航天总医院、江苏省南通医学院第一附属医院、广东省中医院、上海市临床检验中心、中国医学科学院北京协和医院、北京世纪坛医院。本标准主要起草人：杨振华、陈宝荣、王惠民、黄宪章、汪静、居漪、邱玲、张曼。犠犛犜 酶学参考实验室参考方法测量不确定度评定指南范围本标准规定了酶学参考实验室在运行参考方法时测量不确定度的来源、评定测量不确定度步骤及报告方式。本标准适用于酶学参考实验室评定参考方法测量酶催化活性浓度的测量不确定度，也适用于采用分光光度原理测量的其他参考方法测量量值的测量不确定度评定，同时可供认可评审员在评审过程中使用。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。通用计量术语及定义 测量不确定度评定与表示 ：化学分析中不确定度的评定指南术语和定义 界定的以及以下术语和定义适用于本文件。样本狊 犪犿狆 犾 犲从某系统中抽取的一个部件或较多部件，对其分析后可获取该系统的信息，通常为系统属性判定和系统形成提供参考。示例：来源于较大量血清的一定量的血清。示例：一组测量结果的一个无偏移或者随机选择的亚组。确认狏 犪 犾 犻 犱 犪 狋 犻 狅 狀通过检查和提供客观证据，表明能够满足预期应用的特定要求的验证。示例：通常用于测量水中氮浓度的测量程序，同样被确认为可测量人血清中氮浓度。注：预期应用或用户需要是在测量系统以外并与其无关；但是工作性能是测量系统或测量程序的一部分，也就是它在测量系统之内（验证）。验证狏 犲 狉 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀通过检查和提供客观证据表明某一规定项目能够满足特定要求。示例：证明达到测量系统的工作性能或法规要求。注：规定项目可以是过程、测量程序、物质、化合物或测量系统。注：特定要求可以是达到厂家的技术性能。注：化学中，所涉及实体的本质或者活性的验证，要求描述该实体或活性的结构或特性。犠犛犜 缩略语下列缩略语适用于本文件。：变异系数（）：国际临床化学和检验医学联合会（）：室内质控（）：国际理论和应用化学联盟（）：标准（偏）差（）：标准操作程序（）测量不确定度 误差和不确定度 误差是单个数值，原则上已知误差的数值可以用来修正结果。不确定度是以一个区间的形式表示，为一个分析过程和所规定样品类型做评估时，可适用于其所描述的所有测量值。对大多数医学实验室的检测项目而言，测量不确定度大小与测量值高低相关，一般不能用不确定度数值修正测量结果。此外，误差和不确定度的差别还表现在：修正后的分析结果可能非常接近于被测量的数值，因此误差可以忽略。不确定度可能很大，因为分析人员对于测量结果的接近程度没有把握。测量结果的不确定度不可以解释为代表了误差本身或经修正后的残余误差。注：误差是一个理想的概念，不可能被确切地知道。通常认为误差含有两个分量，分别称为随机分量和系统分量，包括以下内容：随机误差通常产生于影响量的不可预测的变化。这些随机效应使得被测量的重复观察的结果产生变化。分析结果的随机误差不可消除，但是通常可以通过增加观察次数加以减少；注：算术平均值或一系列观察值的平均值的实验标准差是由一些随机效应产生的平均值不确定度的度量，而不是平均值的随机误差。由这些随机效应产生的平均值的随机误差的准确值是不可知的。系统误差定义为在对于同一被测量的大量分析过程中保持不变或以可以预测的方式变化的误差分量。它是独立于测量次数的，因此不能在相同的测量条件下通过增加分析次数的办法使之减小。包括：恒定的系统误差：例如定量分析中没有考虑到试剂空白，或多点设备校准中的不准确性，在给定的测量值水平上可能是恒定的，但是也可能随着不同测量值的水平而发生变化；不恒定的系统误差：在一系列分析中，影响因素在量上发生了系统的变化，例如由于试验条件控制得不充分会产生不恒定的系统误差。示例：在进行化学分析时，一组样品的温度在逐渐升高，可能会导致结果的渐变。示例：在整个试验的过程中，传感器和探针可能存在老化影响，可能引入不恒定的系统误差。误差的另一个形式是假误差或过错误差。这种类型的误差使测量无效，它通常由人为失误或仪器失效产生。记录数据时数字进位、光谱仪流通池中存在的气泡或试样之间偶然的交叉污染等是这类误差的常见原因。包括以下内容：假误差并不总是很明显。当重复测量的次数足够多时，通常应采用异常值检验的方法检查这组数据中是否存在可疑的数据。所有异常值检验中的阳性结果都应该小心对待，可能时应向实验者核实。通常情况下，不能仅根据统计结果就剔除某一数值。犠犛犜 过错误差的测量不确定度是不可接受的，不可将此类误差计算到测量不确定度中。然而，因数字进位产生的误差可进行修正，特别是当这种误差发生在首位数字时。测量结果的所有已识别的显著的系统影响都应修正。测量仪器和系统通常需要用测量标准或标准物质进行调节或校准，以修正系统影响。与这些测量标准或标准物质有关的不确定度及修正过程中存在的不确定度应加以考虑。用本文件获得的不确定度并没有考虑出现假误差或过错误差的可能性。不确定度的来源 通常来源在实际工作中，结果的不确定度可能有很多来源，例如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和容量仪器的不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定、随机变化等。酶学参考实验室不确定度主要来源 测量前阶段 抽样和样本准备酶学参考实验室主要工作是给委托的样本赋值，一般不存在取样问题。但如还接受评定样本间变异、样本稳定性等工作时，此时内部或外部取样是规定程序的组成部分，例如不同样品间的随机变化以及取样程序存在的潜在偏差等影响因素构成了影响最终结果的不确定度分量。本文件对此暂不加以讨论。液体样本，常需深低温（如）保存，测量前需加以融冻。应严格控制融冻条件，如规定放置在 水浴。此外在融化后应加以混匀，要严格控制混匀方式、时间和强度等，以控制不确定度来源。冻干粉末样本测量前需加蒸馏水复溶。应严格控制所加蒸馏水质量，应为实验室一级用水。有可能时应用称重法控制加水的量并规定复溶后混匀方法。通过这些措施减小样本准备时产生的测量不确定度。存储条件若测试样品在分析前要储存一段时间，则存储条件可能影响结果。因此，存储时间以及存储条件也被认为是不确定度来源。酶学参考实验室应注意某些酶是冷变性而非热变性。如低温保存样本，会加速乳酸脱氢酶变性，从而产生不确定度。仪器的影响下列仪器会影响酶催化活性浓度的测量结果，包括：分光光度计：主要不确定度来源有波长准确度、半波宽、读数的正确性、噪音和漂移等；移液器：最大允许误差（）和重复性；天平：最大允许误差等。酶学参考实验室应使用最高级?的分析仪器，使用前应检查仪器性能，确保性能在规定的参数内。可按厂家声称的参数评定不确定度。犠犛犜 试剂配制酶反应试剂时有多种不确定度来源，即使配制试剂的原材料已被检测过，因为检测过程存在着某些不确定度，如某些情况下不能知道滴定溶液浓度。许多有机指示剂，纯度并不是 ，可能含有异构体和无机盐。对于这类物质的纯度，制造商通常只标明不低于规定值。关于纯度水平的假设将会引进一个不确定度分量。反应混合液中各种成分浓度变化有可能是测量不确定度的来源：酶促反应速度受各种物质浓度的影响，有底物、激活剂、抑制剂、缓冲物等。当使用酶偶联反应测量酶活性浓度时，需使用各种工具酶（指示酶、辅助酶）和相应底物。参考方法已对试剂中各种物质做了最适浓度的研究和规定。在配制试剂时，只要正确地应用高级?天平称量，浓度变化很小，常可忽略不计，不计算它们的标准不确定度。但注意在称量量很小时，如和测量试剂中的磷酸吡哆醛、测量试剂中，最好通过实验验证这些物质由于称量误差能否引起较大的测量不确定度。试剂的老化和不同批号配制也会引起测量不确定度，如在每个批次测量前重新配制试剂，则测量结果包含了配制试剂引起的不确定度并除去了试剂老化的影响。微量的杂质有可能抑制或激活酶的催化活性，这可能是产生测量不确定度一个很重要的来源。有必要对配制酶测量试剂的原材料制定更严格的要求，如 丙氨酸中 丙氨酸含量，双甘肽中甘氨酸含量等。测量原理 假设的化学反应定量关系当假定分析过程按照特定的化学反应定量关系进行时，可能有必要考虑偏离所预期的化学反应定量关系，或反应的不完全或副反应。测量阶段 测量时环境条件容量玻璃仪器一般在与校准温度不同的环境温度下使用。总的温度影响应加以修正，但是液体和玻璃温度的不确定度应加以考虑。同样，当材料对湿度的可能变化敏感时，湿度也是重要的，此时湿度影响也应加以修正。样品的影响复杂基体的被分析物的回收率或仪器的响应可能受基体成份的影响。被分析物的物种会使这一影响变得更复杂。由于改变的热力情况或光分解影响，样品（被分析物）的稳定性在分析过程中可能会发生变化。当用“加料样品”来估计回收率时，样品中的被分析物的回收率可能与加料样品的回收率不同，因而引进了需要加以考虑的不确定度。空白修正空白修正的值和适宜性都会有不确定度，在痕量分析中尤为重要。其他重要不确定度来源 最终反应混合液的狆犎酶催化反应速度受变化影响，一般而言，每个酶都有其最适反应，并随变化反应速度上升或下降。评定测量不确定度时应考虑此分量。不同酶对反应不一致。在评定测量不确定度时往犠犛犜 往要计算灵敏系数。配制同一的缓冲液常可使用多种化学物质，应选择合适的原料。此时不仅要考虑原料的值，以保证有足够的缓冲能力，还要考虑原料本身是否具有抑制或激活酶催化活性的作用。酶催化反应时的温度温度对酶催化活性浓度有明显的影响，一般而言，温度升高会加速反应，但超过一定温度后，由于酶蛋白变性而反应速度变慢。在评定测量不确定度时往往要计算温度影响的灵敏系数。测量后阶段在计算酶活性浓度时需使用摩尔消光系数，应考虑此系数的不确定度。有些仪器选用直线回归，按斜率计算结果，有时会导致较差的拟合，因此引入较大的不确定度。修约能导致最终结果的不准确，但这些是很少能预知的，所以建议不要在计算过程中，而在计算的最后进行修约，这样可能无必要考虑修约引起的不确定度。其他 实验室条件的影响 温湿度：测量时实验室的温湿度通常对测量有一定的影响，尤其对酶学测量，不同温湿度条件对加样、分光光度计的散热、天平称量等多个与测量有关的环节影响量不同，通常也可产生一定的测量不确定度，但目前尚未找到有效的评定方法，应尽量保持测量时实验室温湿度一致是有效控制测量不确定度的方法。磁场、噪声与振动：由于酶学项目通常采用分光光度计