DB12T 946-2020 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法.pdf

ICS 65.120 B 25 DB12 天津市地方标准 DB12/T 9462020 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法 Determination of amino acids in feeds-Ion exchange chromatography 2020-06-29 发布 2020-08-01 实施 天津市市场监督管理委员会 发 布 DB12/T 9462020 I 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：杨鸿雁、梁世岳、李玉鹏、陈龙宾、范寰、乔家运。DB12/T 9462020 1 饲料中氨基酸的测定 离子交换色谱法 1 范围 本标准规定了饲料中氨基酸的离子交换色谱法测定方法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品的采集与制备、测定步骤和结果计算。本标准适用于饲料原料、配合饲料及浓缩饲料中氨基酸含量的测定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14699.1 饲料 采样 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 3.1 常规酸水解法 饲料中的蛋白质在盐酸的作用下，水解成单一氨基酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。水解中，色氨酸全部被破坏，不能测量，胱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能测准。3.2 氧化酸解法 将饲料蛋白中的含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸）用过甲酸氧化，使之转变为对酸稳定的氧化物，再通过酸水解法释放出来，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。3.3 碱水解法 饲料中的蛋白质在碱的作用下，水解出色氨酸，经离子交换色谱法分离并以茚三酮柱后衍生测定。4 试剂和材料 4.1 本标准所用试剂和水，在没有注明其它要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的一级水；所述溶液如未指明溶剂均系水溶液。试验中所需溶液、制剂及制品，在没有注明其它要求时均按 GB/T 603的规定制备。4.2 盐酸：优级纯。4.3 盐酸溶液（6 mol/L）：量取盐酸 500 mL，用水稀释至 1000 mL，混匀。4.4 茚三酮溶液：按仪器说明书配制或购买。4.5 pH 系列缓冲液、再生液：按仪器说明书配制或购买。DB12/T 9462020 2 4.6 甲酸：浓度为 88%。4.7 过甲酸溶液：将 30%过氧化氢与甲酸按体积比 1:9 混合，室温放置 1 h，置冰水浴中冷却 30 min,临用前配制。4.8 盐酸溶液（7.2 mol/L）：取盐酸 600 mL，用水稀释至 1000 mL，混匀。4.9 氢氧化锂溶液（4 mol/L）：称取一水合氢氧化锂 167.8 g，用水溶解并稀释至 1000 mL，混匀。4.10 柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸三钠 14.71 g、氯化钠 2.92 g 和柠檬酸 10.50 g，溶于 500 mL 水中，加入硫二甘醇 5 mL 和辛酸 0.1 mL，定容至 1000 mL。4.11 氢溴酸（48%）：分析纯。4.12 高纯氮气：纯度为 99.999%。4.13 氨基酸混合标准储备液：含 L-天门冬氨酸、L-苏氨酸等 17 种常规水解分析用氨基酸，各组分浓度均为 2.50 mol/mL。4.14 磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储 备液：准确称取磺基丙氨酸（纯度99.0%）105.7 mg 和蛋氨酸砜（纯度99.0%）113.3 mg，用水溶解并定容至 250 mL,浓度均为 2.50 mol/mL，28保存，有效期 1 年。4.15 色氨酸标准储备液：准确称取色氨酸标准品（色谱纯）127.5 mg，加少许水和数滴 0.1 mol/L氢氧化钠溶液使之溶解，用水定容至 250 ml，浓度为 2.50 mol/mL，28保存，有效期 1 年。4.16 混合氨基酸标准工作液：准确吸取氨基酸混合标准储备液、磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储备液和色氨酸标准储备液各 1 mL，置于 25 mL 容量瓶，用柠檬酸钠缓冲液定容，混匀，各氨基酸组分浓度均为 100 nmol/mL，28保存，有效期 3 个月。5 仪器设备 5.1 样品粉碎机。5.2 样品筛 孔径 0.18 mm。5.3 分析天平 感量 0.1 mg。5.4 恒温鼓风干燥箱。5.5 氮吹仪。5.6 旋涡混合仪。5.7 氨基酸分析仪 具有离子交换柱、茚三酮柱后衍生装置及 570 nm 和 440 nm 光度检测器。6 样品的采集与制备 按GB/T 14699.1采集样品；按GB/T 20195制备样品，要求样品粉碎至过0.18 mm 孔径（80目）样品筛，充分混合均匀后装入密封袋中备用。7 测定步骤 7.1 样品的水解 7.1.1 常规酸水解法 称取试样30 mg70 mg（约含蛋白质5 mg20 mg，精确至0.1 mg）于25 mL水解管中，准确加入10 mL盐酸溶液，充氮气约1 min后拧紧瓶盖，将水解管放入1101恒温干燥箱，水解22 h24 h。冷却至室温，混匀。DB12/T 9462020 3 7.1.2 氧化酸解法 称取试样50 mg100 mg（约含蛋白质7.5 mg25 mg，精确至0.1 mg）于25 mL水解管中，冰水浴冷却30 min后，加入已冷却的过甲酸溶液2 mL，待样品湿润（勿摇），拧紧瓶盖，连同冰浴一起置于04冰箱中，反应16 h，加入0.3 mL氢溴酸，振摇后放回冰浴静置30 min，取出放至室温后，加入10 mL盐酸溶液，充氮气约1 min后拧紧瓶盖，将水解管放入1101恒温干燥箱，水解22 h24 h。冷却至室温，用水将内容物转移到25 mL容量瓶，定容，混匀。7.1.3 碱水解法 称取试样50 mg100 mg（约含蛋白质7.5 mg25 mg，精确至0.1 mg）于10 mL聚四氟乙烯水解管中，加入1.5 mL氢氧化锂溶液，充氮气约1 min后拧紧瓶盖，放入1101恒温干燥箱，水解20 h后，冷却至室温，用水将内容物转移到25 mL容量瓶中，用盐酸溶液中和至pH值为67，定容，混匀。注：以上三种方法依所要测定的氨基酸种类选用。7.2 上机水解液的制备 将上述水解液过滤，取0.5 mL滤液于小试管中，置于氮吹仪，65吹干，必要时加少许水重复蒸干2次3次。准确加入2 mL5 mL柠檬酸钠缓冲液，旋涡混合仪混匀，用0.22 m水系过滤器过滤到上机瓶中，待测。7.3 测定 按照仪器使用说明书放置茚三酮溶液与pH系列缓冲液、再生液，设置仪器色谱条件，将混合氨基酸标准工作液与处理好的样品水解液一同上机测定，仪器自动将试样的各氨基酸色谱峰面积与相应的标准品峰面积对比，计算分析，得出各氨基酸的含量，见图1。图1 混合氨基酸标准工作液色谱图 8 结果计算 DB12/T 9462020 4 8.1 计算方法 氨基酸含量计算见式（1）。W（%）=.(1)式中：W某氨基酸的含量，%；A每毫升上机水解液氨基酸的含量，ng；D稀释倍数；M试样质量，mg。8.2 允许差 对于酸解测定的氨基酸，当含量小于或等于0.5%时，两平行样测定值相对偏差不大于5%；含量大于 0.5%时，相对偏差不大于4%。对于色氨酸，当含量小于0.2%时，两平行样测定值之差不大于0.03%；含量大于或等于0.2%时，相对偏差不大于5%。_