DB12T 838-2018 辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法.pdf

ICS 65.020.20 B 04 DB12 天津市地方标准 DB12/T 8382018 辣椒种子纯度 SSR 分子标记鉴定方法 Method of identifying seed purity of pepper by using SSR-based marker 2018-11-07 发布 2018-12-01 实施 天津市市场和质量监督管理委员会 发 布 DB12/T 8382018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、天津市蔬菜研究中心、黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所。本标准主要起草人：兰青阔、吕敬刚、赵新、王成、兰璞、焦荻、高素燕、陈锐、关海涛、张耀中、焦贺敏。DB12/T 8382018 1 辣椒种子纯度 SSR 分子标记鉴定方法 1 范围 本标准规定了辣椒种子纯度SSR分子标记鉴定方法的原理、仪器设备及试剂、方法步骤、纯度计算。本标准适用于辣椒单交种的纯度鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 3543.2 农作物种子检验规程 扦样 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 种子纯度 seed purity 种子在SSR分子标记带型方面典型一致的程度，用具有本品种特异带型的种子粒数占鉴定样品种子粒数的百分率表示，以反映某品种特征特性的一致性程度。3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction(PCR)一种在体外通过酶促反应扩增特异DNA片段的技术。3.3 简单重复序列 simple sequence repeat(SSR)由几个核苷酸（16个）为重复单位聚集而成的长达几十个至几百个bp（一般为100200）的串联重复序列，又称微卫星序列或短串联重复序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。3.4 分子标记 molecular marker 以蛋白质、核酸分子的多态性为基础，鉴定生物在遗传上的差异。4 原理 SSR分布于辣椒整个基因组，每个位点上重复单位的数目不同造成了品种间的多态性，利用PCR技术将多态的SSR扩增出来，通过电泳检测扩增产物，利用电泳图谱进行辣椒种子纯度鉴定。5 仪器设备及试剂 DB12/T 8382018 2 5.1 仪器设备 PCR仪；测序电泳槽；水平电泳槽；高压电泳仪（3000 V，400 mA，400 W）；万分之一电子天平；微量加样器；磁力搅拌器；台式离心机；紫外-可见成像系统；胶片观察灯；水平摇床；高压灭菌锅；pH计等。5.2 试剂 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；盐酸（HCl，36%）；十二烷基硫酸钠（SDS）；氯化钠（NaCl）；氢氧化钠（NaOH）；硼酸；去离子甲酰胺；溴酚蓝；二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺；尿素；亲和硅烷；剥离硅烷；无水乙醇；四甲基乙二胺（TEMED）；过硫酸铵；冰醋酸；硝酸银；甲醛溶液（37%）；Taq DNA聚合酶（含Mg2+的10PCR缓冲液）；四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）；SSR引物；琼脂糖；Gold View染料；定性PCR试剂盒；DNA提取试剂盒；实验用水为重蒸馏水或符合GB/T 6682规定的一级水等。除特殊说明外，所用试剂均为分析纯试剂。5.3 溶液配制 相关溶液配制方法见附录A。6 方法步骤 6.1 取样 检测样品的分样和保存，应符合GB/T 3543.2的规定，从中随机取100粒以上种子，取其父母本材料各10份。6.2 单粒种子的 DNA 提取 6.2.1 样品预处理 在玻璃培养皿底部垫上一层厚度约3mm的棉花或滤纸，用水浸湿后均匀地撒上检测样品，再于表面覆盖一层纱布，置于光照培养箱中。培养条件为16h 35光照培养，8h 28暗培养，待种子长出子叶后备用。6.2.2 DNA 提取 取单株幼苗子叶，放入1.5 mL离心管中，在液氮中研碎，放入1.5 mL离心管中。将DNA提取液预热到65，每管放入400 L混合样品，将离心管置于65 金属浴或水浴锅中，保温30 min后取下，向离心管中加入400 L 24:1氯仿-异戊醇（V:V），振荡混匀。10 000 g离心10 min。将上清液200 L转入另一支1.5 mL离心管，加入400 L-20 预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000 g离心1 min，弃上清液，加入500 L乙醇乙酸铵溶液，6000 g离心5 min收集沉淀。加入100 L TE（pH8.0）溶液溶解DNA。6.2.3 DNA 的浓度和质量 将DNA适当稀释或浓缩，使其OD260值在0.10.8的区间内，测定并记录其在260 nm和280 nm的吸光度。以1个OD260值相当于50 mg/L DNA浓度来计算纯化DNA的浓度，并进行DNA凝胶电泳检测DNA完整性。DNA溶液的OD260/OD280值应在1.72.0之间，或质量能复合检测要求。6.3 分子标记筛选 DB12/T 8382018 3 用22对核心引物进行PCR反应，扩增双亲及送检样品各10份DNA，筛选带型清晰，双亲间差异大，互补性好的引物作为纯度鉴定的SSR分子标记。6.4 PCR 扩增 6.4.1 反应体系 总体积10 L，包括5 L超纯水、1 L含Mg2+的10PCR缓冲液、0.8 L dNTPs（2.5 mmol/L）、0.6 L SSR引物（10 mol/L）、1 L Taq DNA聚合酶（2.5 U/L）、1 L DNA（3050 ng/L），混匀。6.4.2 反应程序 94 预变性4 min；94 变性45 s，按附录B推荐的引物退火温度退火45 s，72 延伸45 s，循环35次；72 延伸10 min；-20 保存备用。6.5 变性聚丙烯酰氨凝胶电泳 按照附录C规定的方法，进行4.5%变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳检测扩增产物。7 纯度计算 以筛选出来的SSR分子标记为引物扩增送检样品的DNA，通过带型统计，用具有本品种特异带型的种子粒数占检测样品种子粒数的百分率表示纯度，计算公式如下：%100%检测样品种子粒数种子粒数具有本品种特异带型的纯度DB12/T 8382018 4 A A 附 录 A（规范性附录）溶液配制 A.1 DNA提取液 含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA，0.5%SDS，经高压蒸汽灭菌后使用。A.2 引物稀释 按照引物合成单的说明先配制100 mol/L的储存液，取适量储存液稀释40倍，配制浓度为2.5 mmol/L的使用液。A.3 6变性上样缓冲液 去离子甲酰胺49 mL，0.5 mol/L的EDTA溶液（pH 8.0）1mL，溴酚蓝0.125 g，二甲苯青0.125 g。A.4 10电泳缓冲液 Tris 108g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）溶液37 mL，定容至1000 mL。A.5 40%丙烯胺胶 丙烯酰胺190 g，甲叉双丙烯酰胺10 g，定容至500 mL。A.6 A.6 4.5%丙烯胺胶 尿素450 g，10电泳缓冲液100 mL，40%丙烯酰胺胶112.5 mL，定容至1000 mL。A.7 1%亲和硅烷 20 L亲和硅烷，20 L冰醋酸，加无水乙醇至2 mL。现用现配。A.8 2%剥离硅烷 1 mL剥离硅烷，49 mL三氯甲烷。A.9 10%过硫酸铵 0.1 g过硫酸铵溶于1 mL超纯水中。现用现配。DB12/T 8382018 5 A.10 固定液 200 mL冰醋酸，定容至2000 mL。A.11 染色液 4 g硝酸银，定容至2000 mL。A.12 显影液 2000 mL蒸馏水中加入40 g氢氧化钠和10 mL甲醛。DB12/T 8382018 6 B B 附 录 B（规范性附录）22 对核心引物 22对核心引物见表B.1。表B.1 22 对核心引物表 序号 引物 引物序列（53）退火温度 扩增片段大小范围（bp）1 LJ-1 F:AGCCATGGCAGAATTGGAAG R:TTCAGCAGGTTCTGGTTCTGGT 54 97121 2 LJ-2 F:CGCATCTACATCAAGAATCAACCA R:GATGTAGAACAAGGAAGCAGGG 54 150154 3 LJ-3 F:GAUGAATTTTGGAGCCACACAC R:AGGTGAAATGGGCAGTGGTAGA 52 85117 4 LJ-4 F:CAAAACCAAATAGGTCCCCC R:CGCGCAATAATTCAATATCG 60 274342 5 LJ-5 F:TGCGAGTACCGAGTTCTTTCTAG R:GGCAGTCCTGGGACAACTCG 58 81101 6 LJ-6 F:ATGTCGCTCGCAATTTCACT R:CGTAGGGAGGAGCGATAGAG 60 106118 7 LJ-7 F:CGGCCAAATTATTTTTCCCAGT R:TTCCCATAGTTGAAGAUCCTGC 54 136145 8 LJ-8 F:TACGGTTCCTCATCCCAGAAGA R:AGGATGACCAATGTTTTGCCTC 53 138151 9 LJ-9 F:CCCTTCCCTTTTCTCCCTTCTT R:CAGAAACAGCCATTGATGATG 54 142157 10 LJ-10 F:GCGGCCTTTTGATTCATACAAT R:CGTTTTACTGCCCTATCTGCTTG 56 155165 11 LJ-11 F:GCACGAGUCAACAAAAGAGAAT R:CGCTGAUCGAGACAGAGAGAG 53 118121 12 LJ-12 F:TCCCATTTCGCAAGAAAGAAAA R:TCCGATACAGCTGCAGTAGAAAA 54 119135 13 LJ-13 F,TCAGCGATTAAGAATGCGATTG R:CCAAATTGCCCTCTCTCTTCCT 52 116122 14 LJ-14 F:TGTAATTAATTGAGGTGCGCUA R:TCTCTGGTTGACAATTAGGCCC 53 84102 15 LJ-15 F:TCCAAACTACAAGCCTGCCTAACC R:TTTTGCATTATTGAGTCCCACAGC 65 142160 16 LJ-16 F:CCACAAAGGGTTTAAGCAGC R:AAGGCAGGAGCAGAGTTCAA 60 126143 17 LJ-17 F:AATGCGGAGGAAGAAGAGGAAG R:TAGTCCTTATCACCGACACGGC 54 7394 18 LJ-18 F:ACGAGGTCCACTTCCCCATTAT R:TTAGAGAAGGAATAACCGGCAGC 55 106124 19 LJ-19 F:CGCGATTCGATTGCTAAATCTC R:CTAATTTCCCAGTTGCGTCTGC 56 237255 20 LJ-20 F:TTCGGCTATTTGAACAGAAGCA R:TGATCCCTTCTTGTTTGATTTTTG 54 140168 21 LJ-21 F:TTTTGGGGTTCAATAAAGCTGTG R:TTCAACAAGATCATCAATTCACCA 54 150150 22 LJ-22 F:CCAAACGAACCGATGAACACTC R:GACAATGTTGAAAAAGGTGGAAGAC 58 289318 DB12/T 8382018 7 C C 附 录 C（规范性附录）制胶过程 C.1 凝胶制作 将玻璃板洗净，用无水乙醇