DB15T2742-2022 羊溶血性曼氏杆菌分离与鉴定操作规程.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27422022 羊溶血性曼氏杆菌分离与鉴定操作规程 Operating procedures for isolation and identification of sheep Mannheimia haemolytica 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 27422022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：张月梅、赵世华、宋越、白帆、王娜、戴伶俐、张帆、杨斌、刘威。DB15/T 27422022 1 羊溶血性曼氏杆菌分离与鉴定操作规程 1 范围 本文件规定了羊溶血性曼氏杆菌分离与鉴定的操作方法。本文件适用于羊及其产品中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。溶血性曼氏杆菌 Mannheimia haemolytica，Mh 巴氏杆菌科曼氏杆菌属的微生物，球杆状或短杆状菌，两端钝圆，革兰氏染色阴性，典型两端深染，中间浅，单个或成双存在，无鞭毛，有荚膜，不形成芽孢。4 操作步骤 方法概要 检验程序的流程示意图见附录A。试剂和材料 4.2.1 除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 的超纯水。4.2.2 普通琼脂绵羊血平板。称取牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化钠 5.0 g，磷酸二氢钾 1.0 g，琼脂 15.0 g 超纯水 1000 mL，混合，加热溶解，调 pH 至 7.6，115 灭菌 15 min，冷却至 45 时加入无菌脱纤维绵羊血 50 mL 并在无菌操作要求下倾注约 20 mL 至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基平皿宜在 2 8 保存。4.2.3 5%马血清的 TSB。称取胰酪胨 15.0 g，大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0 g，氯化钠 5.0 g，超纯水950 mL，混合，微热溶解，调节 pH 值为 7.3，121 高压蒸汽灭菌 15 min，冷却至约 60 时添加 50 mL 马血清，混匀。制备好的培养基宜在 2 8 保存。4.2.4 麦康凯琼脂培养基。称取蛋白胨 20.0 g，乳糖 10.0 g，牛胆盐 5.0 g，氯化钠 5.0 g，中性红DB15/T 27422022 2 0.03 g，琼脂 14.0 g，超纯水 1000 mL，混合，调节 pH 值为 7.1，121 高压蒸汽灭菌 15 min，冷却至约 60，在无菌操作要求下倾注约 20 mL 至无菌平皿中。加盖后在室温放至凝固。制备好的培养基宜在 2 8 保存。4.2.5 Taq DNA 聚合酶。4.2.6 琼脂糖：电泳级。4.2.7 溴化乙锭。4.2.8 分子量标记：DL-2000。4.2.9 TE 缓冲液。10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。仪器和设备 4.3.1 匀质器和匀质杯。4.3.2 天平：称量范围 0 g500 g，读数精准度 0.01 g。4.3.3 核酸电泳仪。4.3.4 PCR 仪。4.3.5 凝胶成像系统 4.3.6 恒温培养箱：37。4.3.7 恒温水浴锅：37。4.3.8 高压蒸汽灭菌锅。4.3.9 酶标仪。4.3.10 光学显微镜。4.3.11 恒温摇床：37。4.3.12 低温离心机。4.3.13 冰箱。方法 4.4.1 样品采集 活体样品可利用棉拭子深入至鼻腔内部采集鼻腔分泌物，剖检样品主要无菌采集部分羊气管、肺脏或胸水等组织样本，无菌采集样品后应4 保存，24 h内送至实验室。4.4.2 细菌的分离 4.4.2.1 鼻腔拭子的分菌 鼻腔拭子样品放入到装有5 mL 5%马血清TSB的试管中，于37 摇床以250 r/min培养12 h16 h后，划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于37 培养箱培养12 h16 h后观察菌落形态。4.4.2.2 组织样本的分菌 用经火焰灭菌并冷却的接种环蘸取待检组织内部后划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于37 培养箱培养12 h16 h后观察。或以无菌操作取样品5 g，加入装有45 mL，含5%马血清TSB的培养瓶内，均质，于37 摇床以250 r/min培养12 h16 h后，划线接种于普通琼脂绵羊血平板，于37 培养箱培养12 h16 h后观察菌落形态。4.4.3 细菌的鉴定 4.4.3.1 培养特征 DB15/T 27422022 3 溶血性曼氏杆菌在37 培养16 h后，在普通琼脂绵羊血平板和含5%马血清的TSA上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、半透明的菌落，直径约0.3 mm1.2 mm。培养超过48 h后，菌株呈溶血或溶血。在麦康凯琼脂培养基上，该菌生长缓慢，单个菌落呈红色。4.4.3.2 病原特征 取组织样本做组织触片，或取可疑菌落涂片做革兰染色（按GB/T 4789.28的方法进行染色），菌体呈革兰氏阴性，可见粉红色小杆菌，直径约1 m，固体和液体培养基上生长时，培养物均以单个菌落为主，不形成芽孢，有荚膜（按GB/T 4789.28的方法进行染色）。菌落生长特征、革兰染色、菌体形态和普通琼脂绵羊血平板溶血及麦康凯培养基平板单个菌落呈红色符合者，可确定为溶血性曼氏杆菌。4.4.3.3 生化特性 经初步鉴定后，细菌在37 培养16 h后，生化试验结果显示分离菌均能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖等糖类，发酵甘露醇，不发酵甘露糖，氧化酶、触媒阳性，尿酶阴性。4.4.4 玻片凝集试验 将可疑菌落接种于5%马血清TSB，37 培养16 h，取1.5 mL培养物，经12000 r/min离心1 min，弃上清，用100 L生理盐水将沉淀物制成悬浮液，取25 L悬浮液分别和等体积的生理盐水、溶血性曼氏杆菌阳性血清作玻片凝集试验，其中生理盐水作为稀释液对照并观察待检菌株是否有自凝现象。同时设阳性菌株对照。在生理盐水对照不凝集，阳性菌株凝集的情况下，待检菌株出现凝集为阳性反应。4.4.5 溶血性曼氏杆菌 16S rRNA 测序检测 4.4.5.1 PCR 扩增 用无菌接种环钩取培养基上可疑单菌落至含有16S rRNA PCR反应混合物的PCR管中，引物序列参见附录B，混匀，进行PCR扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。扩增条件为95 预变性3 min；95 变性20 s，55 退火30 s，72 延伸40 s，32个循环；72 延伸10 min，4 保存。4.4.5.2 琼脂糖凝胶电泳 在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后加入溴化乙锭制备凝胶，凝固后进行电泳。8 L PCR产物加入2 L上样缓冲液，混匀后加入上样孔，80 V恒压电泳25 min，放入凝胶成像系统紫外线透射检验。4.4.5.3 测序结果比对 凝胶电泳成像结果显示扩增条带在1400 bp处，且无杂带后，可将PCR产物测序，测序结果与标准序列进行比对。5 结果判定 同时符合以下特性者应判为溶血性曼氏杆菌：溶血性曼氏杆菌在 37 培养 16 h 后，在普通琼脂绵羊血平板和 5%马血清的 TSA 培养基平板上形成圆形微凸起、表面光滑、边缘整齐、半透明的菌落，直径约 0.3 mm1.2 mm，大多数菌株呈溶血，部分菌株产生溶血；麦康凯培养基平板上单个菌落呈红色；革兰氏阴性短杆菌，大多数单个存在；DB15/T 27422022 4 发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、L-阿拉伯糖等糖类，发酵甘露醇，不发酵甘露糖，氧化酶、触媒阳性，尿酶阴性；与溶血性曼氏杆菌阳性血清玻片凝集试验阳性；16S rRNA 序列比对与曼氏杆菌属为同一进化分支。6 废弃物处理和防止污染的措施 依据病死及病害动物无害化处理技术规范对废弃物进行无害化处理。DB15/T 27422022 5 A A 附录A （规范性）溶血性曼氏杆菌检测 羊溶血性曼氏杆菌检测流程见图A.1。图A.1 羊溶血性曼氏杆菌检测流程图 DB15/T 27422022 6 B B 附录B （资料性）溶血性曼氏杆菌 16S rRNA 序列的扩增 溶血性曼氏杆菌16S rRNA序列的扩增引物见表B.1。表B.1 用于 16S rRNA 序列扩增的引物 引物 序列 27-F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 1492-R 5-TACCTTGTTACGACTT-3 DB15/T 27422022 7 参考文献 1 中华人民共和国农业部病.死及病害动物无害化处理技术规范.2017年.