SNT 3589.7-2013 出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法 第7部分：鳕鱼成分检测 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3589.7-2013出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法第7部分：鳕鱼成分检测实时荧光PCR法Identification of fish species in export food-Part 7:Detection of cod fish ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民.共。和国发布国家质量监督检验检疫总局SN/T3589.7-20137.15实时荧光PCR反应混合液：12.5uL反应体系包括：1U2U的Tag酶、1XPCR缓冲液、2.5mmol/L4.0mmol/L的Mg2+、0.2U1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A、C、G)TPs、0.2mmol/L0.4mmol/L dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。如果具有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。8检验步骤8.1DNA提取将样品研磨后，称取200mg左右固体样品或200L液体样品于2mL离心管中，加入1.5mLCTAB提取缓冲液和10uL蛋白酶K溶液。60振荡过夜后13000g离心10min,转移上清液到新的离心管中。加入750L三氯甲烷后用力振荡，13000g离心5min,将上清转移到新的离心管中。加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min,13000g离心15min,弃去上清液。加人350 L NaCl溶液将沉淀进行悬浮。再加人350L三氯甲烷，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min。转移上清后加入0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min,13000g离心10min,弃去上清液。加入500L70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200LTE溶液中。立即使用或一20保存备用。也可用等效的DNA提取方法提取模板DNA。8.2DNA浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和Az8。DNA的浓度按式(1)计算：c=AN50/1000(1）式中：cDNA浓度，单位为微克每微升(ug/uL);A260nm处的吸光值；N一核酸稀释倍数。当A260/A28比值在1.71.9之间时，适宜于PCR扩增。8.3实时荧光PCR扩增8.3.1反应体系的体积为25L:实时荧光PCR混合液12.54L、正反向引物(54mol/L)各1.5L、探针(5umol/L)0.5uL、模板DNA5uL,水补足至25L。8.3.2实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：502min;9510min;9515s,601min,35个循环。8.3.3每个样品设置两个平行的反应体系。检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照。用已知含鳕鱼成分的样品作阳性对照，用已知不含鳕鱼成分的样品作阴性对照，用等体积的H2O代替模板DNA作空白对照。9质量控制以下条件有一条不满足时，试验视为无效：a)空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值35.0：b)阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值35.0；c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值30.0。3