SNT 2206.6-2010 化妆品微生物检验方法 第6部分：破伤风梭菌.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 化妆品微生物检验方法第部分：破伤风梭菌犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 犫 犻 狅 犾 狅 犵 犻 犮 犪 犾 犻 狀犮 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊犘 犪 狉 狋：犆 犾 狅 狊 狋 狉 犻 犱 犻 狌 犿狋 犲 狋 犪 狀 犻 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化妆品微生物检验方法第部分：破伤风梭菌 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元书书书前言 化妆品微生物检验方法 分为以下部分：第部分：沙门氏菌；第部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；第部分：肺炎克雷伯氏菌；第部分：链球菌；第部分：肠球菌；第部分：破伤风梭菌。本部分为 的第部分。本部分的附录 为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人：范放、朱海、唐少冰、赵芳、匡燕云。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 化妆品微生物检验方法第部分：破伤风梭菌范围 的本部分规定了化妆品中破伤风梭菌的检测方法。本部分适用于各类化妆品中破伤风梭菌的检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过 本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。实验室生物安全通用要求化妆品卫生规范（卫生部，）方法提要根据破伤风梭菌特有的形态、生物学特征及培养特性，采用厌氧培养法，应用血琼脂平板进行分离，并根据该菌在血平板上菌落周围产生型溶血环，呈迁徙性生长，革兰阳性梭菌，过氧化氢酶阴性等特征以兹鉴别，以小白鼠毒力试验为最终结果判定，对化妆品中可能存在的破伤风梭菌进行定性检验。设备和材料 培养箱：。显微镜。厌氧培养装置。天平：量程，感量。灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀等。样品稀释瓶、试管、吸管、平皿、接种环、载玻片等。注射器：。小白鼠。培养基和试剂 生理盐水（见附录 第 章）。庖肉培养基（见附录第 章）。血琼脂平板（见附录 第 章）。革兰氏染色液。过氧化氢酶试验试剂。破伤风抗毒素。破伤风梭菌检测方法 检测程序破伤风梭菌的检测程序见图。犛 犖犜 图破伤风梭菌检测程序示意图 操作步骤 取样不同类型化妆品的检样制备参照 化妆品卫生规范。增菌培养取 样品稀释液，共份，分别加至管庖肉培养基中，其中一管加入新鲜培养的破伤风梭菌对照菌液 ，为阳性对照。另取一管为阴性对照。将以上各管移入厌氧装置或厌氧培养箱 培养 。阳性菌使肉汤混浊，肉渣部分被消化，微变黑，有腐败臭味。注：如实验室具备厌氧工作站等较好的厌氧培养条件，增菌培养基表层可不加液体石蜡。分离培养取增菌培养液划线接种血琼脂平板，厌氧培养。在此平板上破伤风梭菌呈白色或乳白色，中心紧密、周边疏松，直径 以上，菌落周围产生透明型溶血环，呈迁徙性生长的特征菌落。革兰氏染色镜检取可疑菌落涂片、染色、镜检。破伤风梭菌为革兰氏阳性，营养期细菌呈细丝状，芽孢期细菌产生的芽孢圆形，位于菌体末端，直径比菌体宽大，似鼓槌状，其繁殖体为革兰氏阳性，带上芽孢的菌体有时转为革兰氏阴性。观察芽孢 培养 比较适宜，时间过短芽孢太小或是还没有完全形成，时间过长芽孢大部分会脱落。过氧化氢酶试验挑取固体培养基上可疑菌落于洁净载玻片上，滴加一滴过氧化氢（）溶液，于 内产生犛 犖犜 气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。破伤风梭菌呈阴性反应。增菌产毒培养根据菌落形态、染色镜检和生化特征挑取可疑菌落，接种庖肉培养基做增菌产毒培养，厌氧培养 后进行毒力测定。毒力测定取上述增菌产毒培养液做毒力测定。实验动物选用昆明品系封闭群的清洁级（）或无特定病原菌级（）小白鼠（或其他品系的、级小白鼠），小白鼠饲养在通风、透光、清洁的室内环境，实验期间正常供给标准啮齿动物食物和饮水。选健康小白鼠 只（体重 、雌雄各半），随机分成群，群注射供试品，一群为阳性对照。每群分为两组，分别做毒力试验（试验组）和破伤风抗毒素保护试验（保护组）。试验组中，小白鼠肌肉或皮下注射增菌培养液 ，后观察小鼠症状。破伤风外毒素引起的中毒症状为强直性痉挛，抽搐，呈现角弓反张，最后死亡。保护组中，为判断前述症状是否为破伤风外毒素所致，要进行破伤风抗毒素保护实验。在注射增菌培养液前先注射 破伤风抗毒素 ，后注射增菌培养液 ，后观察小鼠症状。结果判断 阳性结果判断：如试验组小白鼠全部或部分出现破伤风外毒素引起的中毒症状而保护组小白鼠无上述症状时，毒力试验为阳性，可判定有破伤风梭菌存在。阴性结果判断：试验组小白鼠在注射 后全部没有出现破伤风外毒素引起的中毒症状，毒力试验为阴性，可判定没有破伤风梭菌存在。结果报告结果判定以小白鼠毒力实验为准，毒力试验阳性者，不论镜检是否检到破伤风梭菌，均按检出破伤风梭菌报告；若毒力试验阴性，则报告未检出。生物安全措施为保护实验室人员安全，所有培养物和废弃物应小心处置，按照 要求执行。犛 犖犜 书书书犛 犖犜 附录犃（规范性附录）培养基和试剂犃 生理盐水犃 成分氯化钠 蒸馏水 犃 制法溶解后分装到锥形瓶中，每瓶 ，高压灭菌 。犃 庖肉培养基犃 成分牛肉浸液 蛋白胨 酵母膏 磷酸二氢钠 葡萄糖 可溶性淀粉 碎肉渣适量 犃 制法称取新鲜除脂肪和筋膜的碎牛肉 ，加蒸馏水 和 氢氧化钠溶液 ，搅拌煮沸 ，充分冷却，除去表层脂肪，澄清，过滤，加水补足至 。加入除碎肉渣外的各种成分，校正。碎肉渣经水洗后晾至半干分装 试管约 高，每管加入还原铁粉 或铁屑少许。将上述液体培养基分装至每管内超过肉渣表面约，上面覆盖融化的凡士林或液体石蜡 。高压灭菌 。犃 血琼脂犃 成分 豆粉琼脂 脱纤维羊血（或兔血）犃 制法加热溶化琼脂，冷至，以灭菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼脂。犜犖犛书号：定价：元