SNT 2328-2009 化妆品急性毒性的角质细胞试验.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 化妆品急性毒性的角质细胞试验犆 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊犪 犮 狌 狋 犲 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔狅 犳犽 犲 狉 犪 狋 犻 狀 狅 犮 狔 狋 犲犮 狔 狋 狅 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔 狋 犲 狊 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准附录、附录和附录 是规范性附录，附录是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、秦瑶、邱璐、郑秋月。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 化妆品急性毒性的角质细胞试验范围本标准规定了化妆品急性毒性的角质细胞试验方法的基本原理、试验准备、试验过程、结果和报告。本标准适用于化妆品原料和成品细胞毒性作用的筛选和检测。本标准适用于预测啮齿类动物急性经口毒性试验的开始剂量，可作为毒性试验的一部分，结合其他试验用于受试物质毒性的整体评价。本标准也可作为制药、农业和工业受试物质，食品添加剂和接触材料，以及其他污染物的毒性测定参考方法。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。希尔函数犺 犻 犾 犾 犳 狌 狀 犮 狋 犻 狅 狀关于受试物浓度与反应关系的包含个变量的型对数数学模型。犢 （犡）犢是反应，犡是剂量（或浓度）对数，是最小反应，是最大反应，是反应剂量或浓度在最高（）和最低（）中间时的对数，表示曲线的倾斜度。人角质细胞犺 狌 犿 犪 狀犽 犲 狉 犪 狋 犻 狀 狅 犮 狔 狋 犲，犎 犓 犆角质细胞是构成人体表皮的主体细胞，是一种可合成角蛋白的细胞，体内呈分层生长排列；体外分离的角质细胞来源于包皮或胸腹部等处皮肤组织。致死浓度犐 犆 在一定条件下使 细胞生长和活力抑制 的受试物浓度。半数致死浓度犐 犆 在一定条件下使 细胞生长和活力抑制 的受试物浓度。致死浓度犐 犆 在一定条件下使 细胞生长和活力抑制 的受试物浓度。基本原理本标准采用正常人角质细胞，应用中性红摄取（）细胞毒性试验检测受试物的细胞毒性。体外培养的正常哺乳动物细胞不断地分裂增生，毒性物质不论其作用位点和机制如何，都会干扰细胞的分裂增殖过程，导致细胞生长速率下降和数量减少。培养中的正常细胞经受试物暴露后，细胞毒性表现为浓度依赖性的中性红摄取降低，据此可以得出有关细胞完整性受损和生长抑制等作用的信息。中性红（）是一种弱的阳离子染料，极易以非离子扩散方式穿透细胞膜并在细胞溶酶体内聚集。活细胞具有结合和连接中性红染料的特点。外源性物质作用引起的细胞膜表面的改变或溶酶体膜敏感性的改变，犛 犖犜 引起溶酶体膜脆性增高及其他的变化，并逐渐不可逆。这些变化导致细胞吸收和连接 的能力下降。这样就有可能区分活的、损伤的或死亡的细胞。角质细胞 细胞毒性检测程序是基于这一原理设计的一种反映细胞存活活力变化的检测方法。试验准备除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸水或超纯水，本标准列出了特殊试验材料的建议厂家，如有证据证明，可以使用替代品。人角质细胞人角质细胞可用原代或细胞系：）人永生化角质细胞系 ：商品化细胞系，可从美国标准生物品收藏中心（，）获取；）正常人角质细胞（，）：商品化细胞系，可从美国 公司（或 ）获取；）原代人角质细胞（）：来源于儿童皮肤（包皮环切术）或成人皮肤，需符合有关伦理学规定。由实验室自行制备。细胞培养基 人角质细胞无血清基础培养基商品化购置或实验室自行配制，可从美国 公司 （）或 公司 （）获取。人角质细胞培养基补充试剂配制角质细胞完全培养基需补充以下活性成分：重组人表皮生长因子（）、胰岛素（）、氢化可的松（）、庆大霉素、两性霉素和牛垂体提取物（，）。配制上述各种成分的贮备液浓度如下：；胰岛素 ；氢化可的松 ；庆大霉素、两性霉素 ；牛垂体提取物 。上述补充试剂也可以由供应商提供试剂盒，如美国 公司（，）。人角质细胞血清培养基建议用无血清培养基培养角质细胞：）角质细胞系（）血清培养基：基础培养基，、非必需氨基酸、青霉素、链霉素；）和原代人角质细胞血清培养基：含 小牛血清的黄素腺嘌呤二核苷酸培养液（：），含 有 腺 嘌 呤（），表 皮 生 长 因 子（），转 铁 蛋白（），氢化可的松（），胰岛素（），青霉素（），链霉素（）。人角质细胞无血清完全培养基 人角质细胞无血清基础培养基（或 ），添加以下成分：人重组 ，胰岛素，氢化可的松，庆大霉素，两性霉素，牛垂体提取物。添加 氯化钙溶液，钙终浓度为 。完全培养基保存在，不超过周。人角质细胞冻存培养基 基础培养基，含 、青霉素、链霉素、。细胞培养试剂 胎牛血清（）：国产优质或进口，加热灭活 。小牛血清：国产优质或进口。犛 犖犜 裂解酶（）：用于原代人角质细胞分离培养。胰酶 溶液；胰酶溶液与 溶液混匀。胰酶中和液（，）。青霉素链霉素双抗（）：青霉素（），链霉素（）。二甲基亚砜（）：用于细胞冻存。缓冲盐溶液（，）。阳性物质：十二烷基硫酸钠（），或称月桂基硫酸钠（）。磷酸盐缓冲液（，）。氏磷酸盐缓冲液（，）：含钙镁阳离子，葡萄糖随意，用于冲洗。中性红染料（）：组织培养基，液体或粉剂均可。乙醇：无水乙醇用于受试物制备，乙醇用于配制解析液。冰乙酸：分析纯。无 或 平衡盐溶液（）。氯化钙贮备液：制备 贮备液，高压灭菌备用。超纯水。中性红溶液 中性红贮备液首选商 品化的液态 贮存液，如 公 司 的 组 织 培 养 基 贮 备 液（），浓 度 为 。也可由干粉制备 贮备液：干粉溶于 纯水，贮备液应先置于暗处，室温放置个月。中性红培养液 中性红贮备液与预温至 的 完全培养液混合，中性红的终浓度为 ，使用当天配制。培养液应用 的滤膜进行过滤以减少中性红结晶，中性红培养液在加入细胞前应在 水浴中温育，在制备后 内使用，或在离开 水浴后 内使用。中性红解析液（乙醇醋酸液）按体积比配制中性红解析液，含冰乙酸、乙醇和 水。受试物制备见附录。耗材 组织培养瓶：和 ，用于常规培养。培养皿：，用于细胞常规培养。孔平底组织培养微孔板。细胞冻存管。微孔滤膜。带盖无菌玻璃试管（，）。试纸。移液管和吸头。封板膜。仪器和设备 培养箱：温度，湿度，。犛 犖犜 层流洁净柜（生物安全标准）或生物安全柜。恒温水浴箱：温度。倒置相差显微镜。电子天平。孔板分光光度计（酶标仪）：配 滤光片。移液器：单通道或多通道移液器，用于吸取细胞、洗板溶液、培养基和解析液等操作，不可用于吸取受试物。微孔板摇床。细胞计数仪或血球计数器。离心机（最好配有微孔板转子）。水浴超声波破碎仪。磁力搅拌器。旋涡混合器。过滤器过滤装置。抗静电离子发生器消磁枪：用于中和 孔板静电。试验过程 基本要求除 贮备液外的所有溶液、玻璃器皿、吸头等都应无菌，所有操作应在无菌条件和无菌环境下进行。角质细胞毒性试验流程见附录。试验前考虑因素 对于在试验条件下具有挥发性的受试物，的变化可能比较大，尤其当化合物的毒性非常低时，可以采用能透过 但不能透过挥发性受试物的塑料薄膜封闭培养盖加以解决。难溶解于无血清培养基的物质可能不易测试，其体内毒性潜力可能被低估。水中不稳定或发生爆炸的受试物不能用于试验。特异性的攻击处于分裂中细胞的物质，其体内毒性可能被高估。受试物对细胞内溶酶体具有选择性作用时，可能会出现细胞活性读数偏低的情况。如硫酸氯喹，它能改变溶酶体的 值，产生抑制 的作用。除非在经过冲洗后细胞内仍残留有足够量的该种受试物，并能溶解于中性红溶液中，否则红色的受试物在中性红所在的波长范围内产生吸收作用，可能干扰试验结果。角质细胞的培养 角质细胞培养及冻存参见附录。角质细胞的无血清培养用于毒性检测的角质细胞最好一直用无血清培养基培养，含血清培养的细胞用于检测前应改为无血清培养，注意培养基的转换应逐步进行，并记录细胞在转换培养基中形态的变化。无血清培养的角质细胞在组织培养瓶中常规生长成单层，在温度、湿度 和 浓度 条件下培养，每天相差显微镜观察细胞，记录细胞形态学的改变或细胞粘附特性。角质细胞的制备 孔细胞板的分布本试验方法采用 孔板，其结构如图。犛 犖犜 和 溶剂对照（无受试物，有细胞）；个浓度的受试物（：最高浓度，：最低浓度）；个浓度的阳性对照（只加 ，无细胞）（：最高浓度，：最低浓度）；溶剂空白对照（无受试物，无细胞）。图阳性对照和受试物在 孔板的分布 角质细胞接种 孔板达到对数生长期的细胞可接种于 孔板用于检测，操作如下：）当细胞培养瓶中的角质细胞超过 融合（不到）时，去除培养液，用 冲洗两次，每次 ，去除清洗液；）加 胰酶 液于培养瓶，后吸出，室温孵育 ，当超过 的细胞浮动时，轻轻拍打培养瓶使细胞脱壁；）当绝大多数细胞脱壁时，加入 室温胰酶中和液（）轻轻吹打细胞；）用 冲洗培养瓶，将细胞悬液转移至离心管；）犵左右，离心 ，去除上清液；）以完全培养液轻轻吹打，重悬角质细胞沉淀形成单细胞悬液，计数细胞；）以完全细胞培养液制备细胞悬液使细胞密度为 。用多通道移液器，加 完全培养液于 孔板的外周孔（空白），余下孔加 细胞悬液（细胞孔 细胞孔），一种受试物用一个培养板（见图）；）孵育细胞，保证细胞形成 以上单层（约 ），使细胞恢复、贴壁和进入指数生长期；）倒置相差显微镜下观察细胞，保证细胞在整个微孔板上生长相对一致，同时检验试验过程有无错误操作，记录观察结果。受试物染毒性 准备溶液板预先准备一个无菌的空板（孔细胞板），在进行细胞测试之前，在这个空板加入 孔稀释液。受试物、空白对照液的排列顺序和方式应与测试板相同。试验开始时，使用多通道微量移液器将溶液从空白板上转移到测试板的对应孔上，确保起始处理时间的一致，并使开始反应时间的误差减到最小，同时还会避免次序混乱。孔板加样在细胞孵育 后（也即在细胞达到 融合后），直接加入 合适浓度的受试物溶犛 犖犜 液、阳性对照溶液或者溶剂对照溶液到测试孔中。不要更换完全培养基。用同一刻度的多通道移液器将贮备液从溶液板（空白板）转移到测试板上。例如，可以首先转移空白组（，和 列），紧接着从最低浓度到最高浓度加入受试物，这样用同一套吸头就可以完成整个细胞板的加样。溶剂空白对照孔（）（列，列，孔 ，）加入溶剂对照贮备液。无细胞对照孔 和 应该加入某一种浓度的受试物（如：孔 和孔 加入浓度为 的溶液）。孵育细胞 。阳性对照对于每次检测的一组受试物，应设置独立的阳性对照板。如果需要对多个受试物进行多次检测，就要仔细为每一次检测设计好阳性对照，每一组测试都是一个单独的试验。实验负责人将决定有多少受试物需要使用阳性对照。而且从阳性对照（如 ）得出的平均 标准差（去掉极端值）数值，将作为本试验方法敏感性的可接受标准。阳性对照板的排列方法和操作程序与受试物相同（包括浓度设置和结果标准，见）。镜检评价细胞孵育至少 后，相差显微镜观察每个培养板，辨别是否存在细胞接种操作错误，观察对照组与试验组细胞的生长特性。记录由于受试物的毒性作用而发生的细胞形态学的变化，这些记录不能作为细胞毒性的定量指标。对照组细胞出现非预期的生长特性表明可能存在实验误差，并且可能成为实验失败的原因。采用表描述细胞培养情形，确定细胞的量化得分，并做好记录。表细胞培养观察代码代码编号内容正常细胞形态低水平细胞毒性中等水平细胞毒性高水平细胞毒性代码编号内容 存在沉淀物的正常细胞形态 存在沉淀物的低水平细胞毒性 存在沉淀物的中等水平细胞毒性 存在沉淀物的高水平细胞毒性 由于沉淀物观察不到细胞 中性红摄取测定中性红摄取操作如下：）小心除去完全培养基（含有受试物），并用 预热的 小心冲洗细胞。倾倒冲洗液，用吸水纸吸干剩余冲洗液。加 含中性红培养基到所有孔中，孵育。中性红培养基孵育期间（内），观察细胞是否形成中性红结晶体，并做好观察记录。如果有过多的中性红结晶体形成，实验负责人有权决定这个实验无效；）孵育结束后，去除中性红培养基，用 预热的 小心冲洗细胞；）倾倒并吸干 ，准确加入 中性红解析液到所有孔中，包括无细胞组；