SNT 2206.12-2014 化妆品微生物检验方法 第12部分：绿脓杆菌 PCR法.pdf

SN/T2206.1220145试剂和材料5.1 SCDLP液体培养基（见A.1)。5.2DNA提取液：主要成分是SDS、Tris、EDTA。5.3酚-氯仿。5.4异丙醇。5.5PCR扩增引物及目标片断（见附录B)。5.6灭菌双蒸水。5.710PCR缓冲液（见A.2)。5.8琼脂糖。5.96上样缓冲液（见A.3)。5.1050TAE缓冲液（见A.4)。5.11DNA分子量标记物：DL2000.5.12 Eppendorf管和PCR反应管。6仪器设备6.1恒温培养箱：361。6.2PCR仪。6.3电泳仪。6.4凝胶分析成像系统。6.5冷冻离心机：离心力12000g。6.6可调移液器：5L、10L、100L、1000L。7操作步骤7.1样品增菌按照GB7918.1方法制备1：10化妆品稀释液，取稀释液10mL加到90 mL SCDLP液体培养基中，置36士1培养18h24h。注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通营养肉汤培养基。检验含有防腐剂的化妆品时，在每1000mL普通肉汤中加入1g卵磷脂、7g吐温80。7.2模板DNA的提取取样品增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min,尽量吸弃上清；加人750LDNA提取液，沸水浴5min,加酚-氯仿(1：1体积比)700L,振荡混匀，12000r/min离心5min;吸取上清至对应无菌离心管中，加入等体积氯仿，混匀后l2000r/min离心5min;吸取上清至对应无菌离心管中，加人0.6倍体积预冷的异丙醇，混匀，l2000r/min离心5min;轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干，70%乙醇冲洗一次，12000r/min离心5mi;弃上清，沉淀溶于20L核酸溶解液中，保存在一20备用。也可使用等效的商业化DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA。2SN/T2206.12-20147.3核酸纯度和浓度的测定取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按式(1)计算：c=A260NX50t(1)式中：c一DNA浓度，单位为微克每毫升（g/mL)；A260一260nm处的吸光值；N核酸稀释倍数。当浓度为0.34g/mL340g/mL,A26o/A2o比值在1.71.9时，适宜于PCR扩增。7.4绿脓杆菌外毒素A基因保守序列的PCR扩增鉴定7.4.1扩增7.4.1.1PCR反应体系：10PCR buffer5L,上、下游扩增引物(20mol/L)各0.5L,dNTPs(10mmol/L)4L,模板DNA2L,Tag DNA聚合酶(5U/L)0.5L,双蒸水补足体积至50L7.4.1.2PCR反应条件：94预变性5min,94变性30s,60退火30s,72延伸45s,循环30次后72延伸10min,4保存反应产物。7.4.2反应体系对照的设置检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为绿脓杆菌DNA模板，阴性对照为非绿脓杆菌DNA模板，空白对照为双蒸水。7.4.3凝胶电泳检测PCR产物PR产物进行电泳检测，用电泳缓冲液(1TAE)制备1.5%2%琼脂糖凝胶(5560时加入溴化乙锭至终浓度为0.54g/mL,也可在电泳后进行染色)。取5L8 L PCR扩增产物，分别与1uL上样缓冲液混合进行点样，用DNA分子量标记物做参照。3V/cm5V/cm恒压电泳20min40mi,直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录保存。绿脓杆菌外毒素A基因的保守序列长度为397bp。8结果判定8.1样品PCR反应未扩增出长度为397bp的产物，且阳性对照扩增出目的片段，阴性对照和空白对照未检测到397bp目的片段时，结果报告为未检出绿脓杆菌。8.2样品PCR反应扩增出预期大小的条带，且阳性对照扩增出目的片段，阴性对照和空白对照未出现目的条带时，则可判定该样品为假定阳性，应按照GB7918.4进行分离和鉴定确认，最终结果以后者检测结果为准。8.3如果阴性对照出现条带和（或）阳性对照未出现预期大小的扩增条带，本次待测样品的结果无效，应重新进行实验，并排除污染因素。9检测过程中防止交叉污染的措施按照SN/T1193要求执行。10废弃物处理检测过程中的废弃物，收集后进行高压灭菌或在焚烧炉中焚烧处理。