SNT 2329-2009 化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 化妆品眼刺激性 腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验犆 狅 狊 犿 犲 狋 犻 犮 狊狅 犮 狌 犾 犪 狉 犻 狉 狉 犻 狋 犪 狀 狋 犪 狀 犱犮 狅 狉 狉 狅 狊 犻 狏 犲犎 犈 犜 犆 犃犕狋 犲 狊 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年 月第一版 年 月第一次印刷印数 书号：定价 元书书书前言本标准附录 和附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘芳、程树军、许崇辉、焦红、温巧玲、史喜菊、刘慧智。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 化妆品眼刺激性 腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验范围本标准规定了化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚尿囊膜试验的基本原理、试验准备、试验方法、结果和报告。本标准适用于化妆品、化妆品原料化学品眼刺激性腐蚀性作用的筛选和检测。本标准可作为毒性试验的一部分，结合其他替代试验和动物试验用于受试物眼刺激性整体评价。本标准也可作为制药、农业和工业化学物质和污染物毒性测定的参考方法。术语和定义下列术语和定义适用于本标准。眼刺激性 犲 狔 犲 犻 狉 狉 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀眼前部直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜可逆性炎性变化。眼腐蚀性 犲 狔 犲 犮 狅 狉 狉 狅 狊 犻 狅 狀眼前部直接接触受试物后引起的眼及其周围粘膜不可逆性组织损伤。绒毛尿囊膜 犮 犺 狅 狉 犻 狅 犪 犾 犾 犪 狀 狋 狅 犻 犮犿 犲 犿 犫 狉 犪 狀 犲，犆 犃犕胚龄 时，由绒毛膜体壁中胚层和尿囊膜脏层中胚层融合而成，其组织学结构有三层。出血犺 犲 犿 狅 狉 狉 犺 犪 犵 犲血液从 膜血管内流出血管外，可以表现为血管外出现点状出血或絮状的弥漫性出血等多种形式。凝血 犮 狅 犪 犵 狌 犾 犪 狋 犻 狅 狀血管内和血管外蛋白的变性，表现为血管内血流变慢或血栓形成，血管呈现棕黑色，血管外出现混浊和不透明。血管融解犫 犾 狅 狅 犱狏 犲 狊 狊 犲 犾 犾 狔 狊 犻 狊 膜上小血管壁破裂，小血管融解消失。基本原理鸡胚绒毛尿囊膜试验是一种较早被采用的眼刺激性体外评估方法，绒毛尿囊膜（）是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。本试验利用孵化的鸡胚中期绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定量受试物直接与鸡胚尿囊膜接触，作用一段时间之后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标（如：出血、凝血和血管融解）的变化，这些指标反映血管及血管网的形态结构、颜色和通透性的变化，以及反映绒毛尿囊膜蛋白质变性等现象及其受损程度，然后组合得到一个评分，用于评估受试物的眼刺激性。本试验的目犛 犖犜 的是测试受试物引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，标准描述了评价被评估物质潜在的眼刺激性的要素和过程。试验准备 鸡胚 品系和来源白莱杭鸡（）或星杂 （）受精鸡胚，也可选用白洛克（）、麻黄（）或岭南黄鸡（）等品种受精鸡胚，应当选用 鸡胚，鸡胚质量符合相关标准的要求，供应商应具有农业部门认可的 兽药生产、检验用 鸡（蛋）定点生产企业 资格。运输与贮存购买日龄以内的鸡胚，气室朝上贮存于蛋架上运输。应在不影响胚胎活性或发育的情况下转移或运输鸡胚，避免对鸡胚摇动、不必要的倾斜、敲打以及其他机械性刺激。规格要求鸡胚应新鲜、干净、完好，质量 。孵化至日龄时，应照蛋检查，弃去未受精、无活性或有缺陷的鸡胚，严重畸形、破壳或薄壳鸡胚也不能使用。孵化条件室温 ，相对湿度 。孵化温度 ，相对湿度 ，转盘频率次次。日龄的鸡胚孵化时不必旋转。犆 犃犕 制备日龄鸡胚进行照蛋检查，在蛋壳表面标记气室位置；用牙科锯齿弯镊剥去带标记的蛋壳部分，暴露白色蛋膜，应小心操作不破坏蛋膜完整性。用吸管滴加几 氯化钠（）溶液使蛋膜湿润，此时可立即进行下一步操作，否则应将鸡胚置于孵化器或灯光下（防止鸡胚温度降低），放置时间不应超过 。将 氯化钠溶液倾出。小心用镊子去除内膜，保证血管膜不受损。此时应再次观察血管系统的结构，并对其完整性和是否适宜用于试验做出判断。材料与设备 去离子水双蒸水。玻璃器皿：锥形瓶、小烧杯。计或 试纸。解剖器具：牙科用锯齿弯镊刀或尖头镊。微量加样器及一次性适配吸头。微量电动组织匀浆器：用于受试物研磨。电子计时器。冷光源。带自动转盘的孵化器。照蛋器（光源）。体视显微镜。受试物及制备 液体受试物透明液体受试物应以原液未稀释的形式用反应时间法进行试验；不透明液体受试物（混浊和有色的悬浮液体）应采用终点评估法进行试验；不透明的浑浊液体受试物可用适当溶剂溶解稀释成为最高浓度透明溶液，采用反应时间法进行试验。犛 犖犜 固体受试物固体受试物应采用终点评估法进行试验；膏状，微粒状或颗粒样受试物或产品应以原样进行试验而无需稀释：固体受试物试验前应研磨成细微的颗粒（粉状），粉状受试物在刻度容器中（如微量离心管）经轻挤压后体积为 。如有必要对受试物进行稀释，可用 氯化钠或橄榄油（花生油）作为稀释剂。不同稀释剂介质的使用应当证明是合理的。稀释液的制备应与试验在同一天进行。如受试物为膏状物，应将受试物涂布于塑料薄膜（如封口膜）表面成薄层，再将其覆盖于 膜上使受试物与 膜直接接触，作用时间结束后去除薄膜。固体受试物可用蒸馏水溶解，以最大溶解度透明溶液采用反应时间法进行试验。对照物及制备 阴性对照通常选用质量浓度为 的氯化钠溶液，用于受试物作用后冲洗和阴性对照。每次受试物测试均应设置 氯化钠的阴性对照，确保试验条件不会导致刺激性反应出现。溶剂对照如果受试物用橄榄油（花生油）进行稀释，那么试验应设置橄榄油（花生油）为溶剂对照。如果使用除 氯化钠或橄榄油（花生油）以外的其他溶剂或载体，则选择这种溶剂载体作为对照物质。阳性对照每次试验都应设置一个已知眼刺激物，如果检测试验只是用于鉴定腐蚀性或严重刺激性物质，则阳性对照物应当是一种在体内与 都能够产生严重反应的物质，如 、氢氧化钠。为了评估受试物眼刺激性的严重程度，也可选用反应变化过程不过于剧烈的阳性物质为对照，如不同浓度的乙酸。阳性对照物的选择应当基于有效、可信的体内试验资料。基准物质对照基准对照的设置主要用于证明试验方法的有效性，特别是用于检查每批鸡胚的反应性，检测浑浊受试物、分类比较特殊的受试物、具有特殊眼刺激反应的受试物，或评价一种眼刺激物的相对刺激能力等情况下。基准对照物质应当具有以下特性：稳定可靠的来源、结构和功能与受试物的化学分类相似、物理化学特性已知、体内兔眼试验效应已知、预期反应的程度已知。推荐选用基准阳性参考物质为脂肪醇醚硫酸钠盐混合物（：）。试验过程 预试验 预试验目的确定受试物是否适合用本方法试验，及确定正式试验是采用反应时间法或终点评价法进行试验，见附录。预试验过程预试验用只鸡胚，取 未稀释的液体受试物，固体受试物的使用量应确保覆盖至少 的 表面。受试物作用后立即观察 反应情况至 止，记录观察结果。如果为固体或浑浊液体受试物，作用一定时间后（如 ），用生理盐水冲洗，记录观察结果。预试验前应检查每批鸡胚的反应性，每次至少用只鸡胚进行测试，作用时间限定 内。参考浓度为：产生轻度出血和弱的血管融解；产生中度出血和中等血管融解；产生重度出血和血管融解。受试物局限性如果预试验结果表明受试物的物理特性，既不能用反应时间法也不能用终点评估法进行试验，则正式试验不必进行，这些情况包括：对血管具有药理作用的血管活性物质；对 具有不可逆染色作用的染料：对 膜具有粘附作用的粘性物质。犛 犖犜 正式试验 试验分组每组至少只胚，如果需要，还应另外设置阳性物质（基准物质）和溶剂载体对照各只鸡胚。反应时间法用于透明液体受试物。对浑浊液或固体受试物的检测，可选用适当溶剂溶解稀释的最高浓度透明溶液进行试验。取上述透明液体 直接滴加于 表面，观察 反应情况，并记录作用 内每种毒性效应出现的时间。终点评价法用于微粒状、颗粒状、膏状等固体和浑浊液体受试物的检测。取 经挤压的固体、微粒或颗粒物（已经研磨成微细颗粒）直接作用于，确保至少 的 表面被受试物覆盖，或直接将涂布膏状物的薄膜与 膜接触。作用 后，用生理盐水轻轻冲洗 膜上的受试物，冲洗操作可能很快将 膜上轻度的出血变化掩盖，因此应在 冲洗完成后观察结果，观察每种毒性效应变化的程度。如果观察表明全部只鸡胚至少种反应的评分为中度以上（总评分），试验应重复一次。为进一步了解固体和浑浊性刺激性物质在溶解状态下的刺激特性，以受试物在水中的最高溶解度的透明溶液重复一次试验，用反应时间法进行评价。最终结果评价应以未稀释的受试物原剂型采用终点评法为准。结果观察 出血指血液从 的血管和（或）毛细血管流出，出血可以表现为多种形式，如以菜花状、平滑状、弥散的纱状或点状出血（由于血液从血管膜的不同区域有选择性的流出所致）；根据严重程度不同，对出血进行分级和记分。）无出血（分）；）轻度出血（分）：仅见细小血管出血和少量出血（如 ，作用 ）；）中度出血（分）：小血管和大血管出血，并有明显量的血液流出（如 ，作用 ）；）重度出血（分）：几乎所有血管都出血，大量血液流出（如 ，作用 ）。应当注意，出血可能是短暂的，前 秒观察到的大量出血可能会覆盖随后发生的出血反应。凝血指血管内和血管外蛋白的变性，通常仅见于大和中等大的血管，不包括毛细血管发生的变化。血栓：即血管内凝血，因不同原因引起的血管内血流的中断，如血管压力的改变、管壁肿胀等，表现为血管内深色的凝血点。血管外凝血：可表现为血管外深色的凝血点；还可表现为浑浊（不透明），出现于膜的全部或一部分，可能是近似于乳白色薄纱样，或者呈乳浊状。需要仔细检查不要将凝血与受试物在水溶液中理化性质的变化相混淆（如形成胶体、沉淀等）。按严重程度不同对凝血分级和记分：）无凝血（分）；）轻度凝血（分）：血管内和（或）血管外轻度凝血，和（或）膜轻度浑浊（轻度凝血如 氢氧化钠作用 ，轻度浑浊如 乙酸作用 ）；）中度凝血（分）：血管内和（或）血管外中度凝血，和（或）膜中度浑浊（中度凝血如 氢氧化钠作用 ，中度浑浊如乙酸作用 ）；）重度凝血（分）：血管内和（或）血管外重度凝血，和（或）膜重度浑浊（重度凝血如 氢氧化钠作用 ，重度浑浊如 乙酸作用 ）。血管融解指 膜上血管消失，可能是由于出血、血管壁张力变化等多因素变化所致。按严重程度不同对血融解分级和记分：犛 犖犜 ）无血管融解（分）；）轻度血管融解（分）：仅小血管融解（如 ，作用 ）；）中度血管融解（分）：小血管和大血管融解（如 ，作用 ）；）重度血管融解（分）：大血管和全部血管树都融解（如 ，作用 ）。要求观察并记录出血、凝血和血管融解出现的时间和毒性效应变化的程度，精确到秒。其他 变化信息的收集对于进一步分析和回顾性研究非常有用。必要时应拍照并保存试验图片，并将观察结果与实验室历史资料或有关参考图片作对比。结果和报告 刺激评分法（犻 狉 狉 犻 狋 犪 狋 犻 狅 狀狊 犮 狅 狉 犲，犐 犛）采用反应时间法进行的试验，应用式（）计算刺激评分（），结果保留小数点后两位：（）（）（）（）式中：（出血时间 ）膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒（）；（血管融解时间 ）膜上观察到开始发生血管融解的平均时间，单位为秒（）；（凝血时间 ）膜上观察到开始出现凝血的平均时间，单位为秒（）。根据计算的 数值按表对受试物眼刺激性进行分类。表刺激评分法结果评价刺激评分刺激性分类 无刺激性 轻刺激性 中度刺激性 强刺激性腐蚀性 终点评分法（犲 狀 犱狆 狅 犻 狀 狋 狊 犮 狅 狉 犲，犈 犛）采用终点评价法进行的试验，应计算终点评分（），结果保留小数点后两位：每只鸡胚记分每只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的和；只鸡胚得分的数学总和的平均值。根据 数值按表