SNT 0764-2011 新城疫检疫技术规范.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 ，新城疫检疫技术规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉狀 犲 狑 犮 犪 狊 狋 犾 犲犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 出口家禽新城疫病毒检验方法、新城疫病毒中强毒株检测方法荧光 法、新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程 和 新城疫病毒分离及鉴定方法。本标准与 、和 相比，主要技术变化如下：增加了临床诊断；增加了反转录 聚合酶链反应（）；删除了毒力测定的鸡胚平均致死时间（）和静脉致病指数（）。本标准修改采用 陆生动物诊断试验和疫苗手册（版）（）中第 章。本标准与 第 章相比，主要技术差异如下：本标准完全采用了 规定的病原分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验方法；本标准增加了 中提及但没有详细操作规程的反转录 聚合酶链反应、荧光反转录 聚合酶链反应的具体试验步骤；本标准删除了 中提及但没有详细操作步骤的酶联免疫吸附试验。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。本标准主要起草人：徐海聂、胡永强、罗宝正、谷强、张常印、薄清如、廖秀云、王云华、沙才华、管恩平、邱阳、朱广勤、王海艳。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：；。犛 犖犜 新城疫检疫技术规范范围本标准规定了禽类新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录 聚合酶链反应、荧光反转录 聚合酶链反应的操作规程。本标准适用于进出口禽类及其产品中新城疫的检疫。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法临床诊断 发病症状新城疫简介参见附录。当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：）发病急，死亡率高；）体温升高，极度精神沉郁，呼吸困难，食欲下降；）粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；）出现扭颈、翅膀麻痹等神经症状；）免疫禽群出现产蛋下降。病理变化当禽出现以下肉眼可见的病变时，可作为初步诊断定性的依据之一：）全身粘膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；）腺胃粘膜水肿，乳头和乳头间有出血点；）盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；）十二指肠和直肠粘膜出血，有的可见纤维素性坏死病变；）脑膜充血和出血，鼻道、喉、气管粘膜充血、偶有出血，肺可见淤血和水肿。当禽出现上述病变时，应进行实验室确诊。实验室诊断 病毒分离与鉴定 设备、材料和试剂 器材：生物安全柜、离心机、型微量血凝板、微量可调移液器、恒温箱等。犛 犖犜 抗生素：青霉素、链霉素、卡那霉素和制霉菌素等。日龄 日龄 鸡胚、日龄 雏鸡。，等渗磷酸盐缓冲液（）：配制方法见附录。磷酸氢二钠：配制方法见附录。阿氏液：红细胞保存液，配制方法见附录。鸡红细胞（）：配制方法见附录。拭子：脱脂棉球直径约 ，高压蒸汽灭菌 。新城疫病毒标准阳性血清和标准阴性血清：由指定单位提供。样品采集和制备 活禽采集咽喉拭子和泄殖腔拭子（需带有可见粪便），雏禽采集新鲜粪便。死禽无菌采集肺、肾、肠（包括内容物）、脾、脑、肝、心组织和骨髓，采集咽喉拭子。这些样品可单独或者混合存放，但肠内容物需单独处理。样品置于含抗生素的 等渗磷酸盐缓冲液（），组织和咽喉拭子保存液中含青霉素（）、链霉素（）、卡那霉素（）和制菌霉素（），而粪便、肠内容物和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高倍。加入抗生素后用 磷酸氢二钠调 值到 。粪便和搅碎的组织，用含抗生素的 制成 （质量浓度）的悬浮液，拭子浸入含抗生素的 中，充分振荡。在作用或过夜，或室温（不超过）作用，或 作用 。拭子在反复挤压后弃去。离心 ，取上清液经 滤膜过滤除菌。采集或处理的样品在条件下保存应不超过，若需长期保存，应放置 冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。病毒分离培养 鸡胚接种吸取除菌液经尿囊腔接种至少枚日龄 日龄的 鸡胚，枚，孵育。接种后每天检查鸡胚生长情况。病毒收获收集死胚、濒死鸡胚和培养结束时存活的鸡胚，置冰箱致冷，无菌采集尿囊液。病毒鉴定 血凝试验（犎 犃）用 检测尿囊液的血凝活性。呈阴性反应的尿囊液用另一批日龄 日龄的 鸡胚至少再传代一次，若 结果仍为阴性，则判定新城疫病毒分离阴性。试验方法同 。血凝抑制试验（犎 犐）呈阳性的尿囊液用新城疫病毒标准阳性血清进行 试验，以确认是否有新城疫病毒的存在。试验方法同 。犛 犖犜 脑内接种致病指数（犐 犆 犘 犐）测定 滴度高于（大于）的新鲜感染尿囊液（不超过 ，细菌检验为阴性），用等渗无菌盐水作 倍稀释，不加添加剂如抗生素。脑内接种出壳 的 雏鸡，共接种 只，每只接种 。每 观察一次，共观察。每天观察应给鸡打分，正常鸡记作，病鸡记作，死鸡记作（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作）。犐 犆 犘 犐是每只鸡内所有每次观察数值的平均数，计算方法见式（）：犐 犆 犘 犐狊犱犜（）式中：狊 累计发病数；犱 累计死亡数；犜 累计观察鸡的总数。犐 犆 犘 犐越大，新城疫病毒致病性越强，最强毒力病毒的犐 犆 犘 犐将接近最大值，而弱毒株的犐 犆 犘 犐近于。使用弱毒疫苗，分离株的犐 犆 犘 犐值在 以上，可认为强毒力病毒感染。血凝（犎 犃）和血凝抑制试验（犎 犐）材料和试剂 器材：型微量血凝板、微量可调移液器等。，等渗磷酸盐缓冲液（）。鸡红细胞（）。标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。抗原：配制方法见附录。样品采集和处理 新城疫病毒悬液：无菌收取鸡胚尿囊液。鸡血清：无菌采取动物血液，凝固后分离血清，置于或 保存备用。除鸡外其他禽种的血清：需排除血清对鸡红细胞的非特异性凝集，处理方法为每 血清加 鸡红细胞泥，轻轻振荡，静置至少 ，澄清，离心 ，红细胞沉聚，吸出吸附过的血清供检。血凝试验（犎 犃）在 型微量血凝板中每孔加 。见表。犛 犖犜 表血凝试验操作术式单位为微升 第孔加入 病毒悬液（如尿囊液），为精确计算血凝单位，病毒悬液开始可以作一系列密集稀释，如，等。将病毒悬液或抗原在反应板上作 的系列倍比稀释。第 孔不加病毒悬液或抗原，设立为红细胞对照孔。每孔再加 。每孔加入 。轻叩微量血凝板混合反应物，室温（约）静置 ，或静置 （若周围环境温度太高），在对照孔的 显著呈钮扣状时判定结果。判定时，应将反应板倾斜，观察 有无呈泪珠样流淌，完全凝集（无泪珠样流淌）的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，表示个血凝单位（），再根据开始的稀释倍数精确计算血凝滴度。血凝抑制试验（犎 犐）在 型微量血凝板中每孔加入 。见表。表血凝抑制试验操作术式单位为微升 第一孔加 血清。在血凝板上将血清作横向的 的倍比稀释。每孔加入 抗原，室温下（）静置不少于 ，不少于 。每孔加入（体积分数）的 ，轻晃混匀后，室温（约）静置约 ，如环境温度太高时，放置约 ，当对照孔 呈显著钮扣状时判定结果。犛 犖犜 每次测定应设已知滴度的阳性血清、阴性血清和红细胞对照。结果判定如下：）红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作；凝集记作；凝集记作；凝集记作；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含 和 ）流淌相同的孔判定为不凝集或血凝抑制，记作；）完全抑制 抗原的最高血清稀释倍数为 滴度；）检查各种对照。阴性对照血清 滴度不高于（或 ），阳性对照血清 滴度应在已知滴度的一个稀释度以内，红细胞对照无自凝现象，结果有效，试验成立；）如果（或 ）稀释的血清或者高于这个稀释度的血清能抑制 的抗原，这种 滴度被判为阳性。在所有的确诊试验当中针对试验采用的 应设抗原滴度的追溯性测定。反转录 聚合酶链反应（犚 犜 犘 犆 犚）主要仪器设备 仪。凝胶电泳仪。电泳仪。紫外凝胶成像管理系统。高速冷冻离心机。微量可调移液器。生物安全柜。试剂 水：配制方法见附录。裂解液 ：保存。三氯甲烷：预冷。异丙醇：预冷。乙醇：用新开启的无水乙醇和 水配制，预冷。（）：，高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各 。反转录和 缓冲液。反转录酶（）：保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。酶抑制剂（）：保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。犜 犪 狇 聚合酶（）：保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。：含 、各 。氯化镁（）。电泳缓冲液（贮存液）：配制方法见附录。溴化乙锭溶液（）：配制方法见附录。琼脂糖凝胶：配制方法见附录。相对分子质量标准物 ：。上样缓冲液。犛 犖犜 引物（）：。根据基因序列设计，扩增产物长度为 。上游引物 下游引物 样品的采集与前处理 活禽和内脏组织：见 。血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中。试验步骤 样品核酸的提取 在样品处理区，取狀个 灭菌离心管，其中狀为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。每管加入 裂解液，然后分别加入待测样品、阴性对照和阳性对照各 ，一份样品换用一个吸头。再加入 三氯甲烷，混匀器上振荡混匀 ，室温静置 。于条件下，离心 。取与 中相同数量的 灭菌离心管，加入 异丙醇（预冷），对每个管进行编号。吸取 离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸取 ，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。于条件下，离心 （离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加入 乙醇，颠倒洗涤。于条件下，离心 （离心管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。离心 ，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样品换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥约 。不宜过于干燥，以免 不溶。加入 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 ，离心，冰上保存备用。提取的 应在内进行 扩增或保存于 冰箱，将核酸转移至反应混合物配制区。犚 犜 犘 犆 犚扩增以下操作应在反应混合物配制区的冰盒上进行，按表配制 反应体系。试验过程中要设立阳性对照、阴性对照和空白对照。建议配制检测样品总数所需反应液，可以多配一个样品使用量。表犘 犜 犘 犆 犚 反应体系配置表组分用量 缓冲液 反转录酶 酶抑制剂 犜 犪 狇 聚合酶 上游引物 犛 犖犜 表（续）组分用量下游引物 模板 水 总体积 将以上反应体系瞬时离心充分混匀后，置 仪内运行下列程序：，个循环；，个循环；，个循环；，个循环；产物置保存。犘 犆 犚产物电泳制备 琼脂糖凝胶板，取 产物和 上样缓冲液混匀，加入凝胶板加样孔，同时加 、阴性对照和阳性对照。电压电泳 。紫外凝胶成像管理系统内观察结果、照像。结果及判定 阳性对照出现 目的条带，阴性对照和空白对照均未出现目的条带，试验成立。被检样品出现 目的条带，判为阳性。被检样品未出现 目的条带，判为阴性。对于扩增到的目的片段，需进一步进行序列测定，从分子水平确定其致病性强弱。根据序列测定结果，对毒株基因编码的氨基酸序列进行分析，如果毒株 蛋白的 端有“多个碱性氨基酸残基”，蛋白的端即 位为苯丙氨酸，可确定为新城疫强毒感染。“多个碱性氨基酸”指在 位到 位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸。实时荧光反转录 聚合酶链反应（荧光 犚 犜 犘 犆 犚）试剂和仪器 试剂 新城疫病毒荧光 检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附录。其他试剂见 。主要仪器设备 荧光 仪。其他仪器设备见 。样品的采集与前处理见 。犛 犖犜 试验步骤 样品核酸的提取见 。扩增试剂准备与配制在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出 反应液，在室温下融