SNT 2415-2010 进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法 实时荧光PCR法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光犘 犆 犚法犚 犪 狆 犻 犱犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犛 犪 犾 犿 狅 狀 犲 犾 犾 犪犻 狀犿 犻 犾 犽犪 狀 犱犿 犻 犾 犽狆 狉 狅 犱 狌 犮 狋 狊 犳 狅 狉犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犘 犆 犚犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录 为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出入境检验检疫局。本标准主要起草人：袁飞、郑海松、邵碧英、杨海荣、祝长青、赵贵明、张菲菲、赵勇胜、吴亚君、黄文胜、陈颖、徐宝梁。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光犘 犆 犚法范围本标准规定了进出口乳及乳制品中沙门氏菌的实时荧光 检测方法。本标准适用于进出口乳及乳制品中沙门氏菌的快速检测。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验 分析试验室用水规格和试验方法 基因检验实验室技术要求缩略语下列缩略语适用于本标准。犘 犆 犚狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀聚合酶链式反应。实时荧光犘 犆 犚实时荧光聚合酶链式反应。犇 犖 犃犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱脱氧核糖核酸。犱 犖 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧核苷酸三磷酸。犱 犃 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧腺苷三磷酸。犱 犆 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胞苷三磷酸。犱 犌 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犛 犖犜 犱 犜 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胸苷三磷酸。犆 犜 犃 犅 犮 犲 狋 狔 犾 狋 狉 犻 狋 犺 狔 犾 犪 犿犿 狅 狀 犻 狌 犿犫 狉 狅 犿 犻 犱 犲十六烷基三甲基溴化铵。犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊（犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾）犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲三（羟甲基）氨基甲烷。犈 犇 犜 犃 犲 狋 犺 狔 犾 犲 狀 犲犱 犻 犪 犿 犻 狀 犲 狋 犲 狋 狉 犪 犪 犮 犲 狋 犻 犮犪 犮 犻 犱乙二胺四乙酸。犆 狋值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。实验条件的一般要求实验过程中的措施按照 中的规定执行，以防止交叉污染。测定方法 方法提要乳及乳制品经增菌后，取增菌液 加到 无菌离心管中，犵离心 ，尽量吸弃上清液；提取，取 模板进行荧光 扩增，观察荧光 仪的实时曲线，对乳及乳制品中的沙门氏菌进行快速检验。试剂和材料除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合 中一级水的规格。所有试剂均用无 酶污染的容器分装。检测用引物（对）序列 引物（对）。探针 。犜 犪 狇 聚合酶。：。核酸裂解液：，盐酸（），氯化钠，（）。缓冲液：盐酸（），氯化钾，氯化镁。仪器和设备 实时荧光 仪。离心机：最大离心力 犵。微量移液器：、。犛 犖犜 恒温培养箱：。恒温水浴箱：。冰箱：，。高压灭菌器。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。计。天平：感量 。检验程序检测程序见附录 图 。步骤 取样和增菌取样前消毒样品包装的开启处和取样工具，无菌称取样品 加入装有 预热到 的灭菌水的三角瓶中，使样品充分混匀，培养 。分别移取培养 的悬液各 加入 缓冲蛋白胨水中，培养 。模板犇 犖 犃准备每瓶培养的缓冲蛋白胨水分别取 加到 离心管中。犵 犵离心 ，去上清液。加入 核酸裂解液，重新悬浮起来。水浴 后，冷却至室温。犵 犵离心 ，将上清液移至干净的 离心管中。加入 倍体积的异丙醇，放入冰箱静置或过夜。犵 犵离心 ，去上清液，吸干。乙醇轻柔倒置几次洗涤，犵 犵离心 ，小心去上清液。吸干，风干 。双蒸水保存（如不能及时检验，放置 保存）。也可以使用经过评估的等效的细菌核酸提取试剂盒。犇 犖 犃浓度和纯度的测定取适量 溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测 和 处的吸收值。的浓度按照式（）计算。犮犃 犖（）式中：犮 浓度，单位为微克每毫升（）；犃 处的吸光值；犖 核酸稀释倍数。当浓度为 ，犃 犃 比值在 之间时，适宜于实时荧光 扩增。实时荧光犘 犆 犚检测反应体系总体积为，其中含：缓冲液，引物对（）各，（），犜 犪 狇 聚合酶（），探针，水，模板（浓度约 ）。反应步骤一：预变性 。反应步骤二：变性，退火延伸，个循环。检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以沙门氏菌纯培养物提取的 为阳性对照，以大肠杆菌或其他非沙门氏菌属肠杆菌纯培养物提取的 为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品设个重复，对照设个重复，以 平均值作为最终结果。结果判断及报告 犘 犆 犚体系有效性判定空白对照：无荧光对数增长，相应的 。犛 犖犜 阴性对照：无荧光对数增长，相应的 。阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 。以上三条有一条不满足，实验视为无效。检测结果判定在符合 的情况下，被检样品进行检测时：如有荧光对数增长，且 ，则判定为被检样品筛选阳性。如无荧光对数增长，且 ，则判定为被检样品筛选阴性。如 ，则重复一次。如再次扩增后 仍为，则判定沙门氏菌筛选阳性；如再次扩增后无荧光对数增长，且 ，则判定沙门氏菌筛选阴性。筛选阴性的被检样品报告未检出，筛选阳性的被检样品，按照传统检测方法 进行确证，报告以传统检测结果为准。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）荧光犘 犆 犚检验方法程序图犃 程序图犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准进出口乳及乳制品中沙门氏菌快速检测方法实时荧光犘 犆 犚法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元