SN 0537-1996 出口肉品中红霉素残留量检验方法杯碟法.pdf

ISN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 5 3 7 一 1 9 9 6出口肉品中红霉素残留量检验方法 杯碟法Me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f e r y t h r o my c i nr e s i d u e s in m e a t f o r e x p o r t-C y l i n d e r p l a t e me t h o d1 9 9 6 一 0 4 一 2 9 发布1 9 9 6 门 0 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布S N 0 5 3 7-1 9 9 6前言 本标准是根据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则第 1 单元:标准的起草与表述规则第 1 部分:标准编写的基本规定 及S N/T 0 0 0 1-1 9 9 5 出口 商品中 农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定的要求而进行编写的。其中测定方法采用 美国公职分析化学家协会公定分析方法 第1 5 版中抗生素红霉素残留量分析方法。技术内容与原方法相同，经验证后，按规定格式要求仅作了编辑性修改。在标准中同时制定了抽样和制样方法。测定低限是根据国际上对肉品中红霉素残留量的最高限量和测定方法的灵敏度而制定的。本标准的附录A为标准的附录。本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国上海进出口商品检验局。本标准主要起草人:李慧珠、朱治平、吴仲梁。本标准系首次发布的行业标准。中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口肉品中红霉素残留量检验方法 杯碟法s N 0 5 3 7 一1 9 9 6 M e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t io n o fe r y t h r o my c i n r e s i d u e s i n me a t f o r e x p o r t -Cy l i n d e r p l a t e me t h o d范围本标准规定了出口肉品中红霉素残留量的检验抽样、制样和杯碟测定方法。本标准适用于出口禽肉中红霉素残留量的检验。抽样和制样2.1 检验批 以不超过 2 5 0 0 件为一检验批。同一检验批的产品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1-2 51 2 6 -1 0 0 5 1 0 1 -2 5 0 1 0 2 5 1 5 0 0 1 5 5 0 1 1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 一 2 5 0 0 2 02.3 抽样方法 按 2.2 规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，抽取原始样品的总量不少于2 k g 加每件中 无小包装或有小包装，但每袋小包装重量 超过2 k g 者，可用灭菌刀具从抽出的 包件中，每件割取不少于 1 0 0 g,混合后，置于清洁容器内，作为原始试样，混合的试样总量不少于2 k g，加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4 试样的制备 从取回的原始样品中取出部分样品，将可食部分放人纹碎机内绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于5 0 0 g，作为试样，装入清洁容器内，加封后标明 标记。2.5 试样保存 将试样于一1 8 C以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化中华人民共和国国家进出口商品检验局 1 9 9 6-0 4 一 2 9 批准1 9 9 6 一 1 0 一 0 1 实施 1S N 0537 一 1 9963 测定方法3.1 方法提要 利用被测定样液中的残留红霉素与藤黄微球菌作用，产生抑菌圈。试样用 2 0%的甲醇一 二甲氧基甲炽溶液提取。提取液经离心浓缩后，溶于缓冲溶液(p H 8.0)中并定容，用杯碟法测定，对照红霉素标准曲纹定量。3.2 试剂和材料3.2.1 红霉素标准品:由卫生部药品生物制品检定所提供。3.2.2 二甲氧基甲烷 C H,(C O C H)z 口:化学纯。3.2.3 磷酸盐缓冲液(p H 8.0):0.1 m o l/L，称取1 6.7 3 g 无水磷酸氢二钾及。.5 3 g 无水磷酸二氢钾，溶于水，定容至1 0 0 0 m L o3.2.4 试验菌种:藤黄微球菌(M i c r ce a c c u s L u t e u s)，菌株号2 8 0 0 1,3.2.5 红霉素标准储备液:准确称取一定量红霉素标准品(精确至。.1 0 m g)，用二甲 氧基甲烷溶液，使红霉素液的浓度为1 0 0 0 k g/m L，再用磷酸盐缓冲液(p H 8.0)稀释，使最终浓度为1 0 0 K g/m L，保存于4 冰箱备用(不宜超过一周)。3.2.6 红霉素标准工作液:取上述储备 液用 磷酸盐缓冲液稀释，配制成。0 2 5,0.0 5,0.1 0,0.2 0,0.4 0,0.8 0 p g/m L 的标准工作液，作为 制备标准曲 线的 标准 工作 液。需当 天配 制，当夭使用。3.2.7 肉汤培养基(见附 录A中A l).3.2.8 菌种培养基(见附录 A中 A 2).3.2.9 检定培养基(见附 录A中A 3).3.3 仪器与设备3.3.1 培养皿:内径 9 0 m m,底部平整、光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。3.3.2 牛津杯:外径(7.8 士0.1)m m，内径(6.0 士0.llmm，高(1 0 士0.1)mm的不锈钢管。3.3.3 游标卡 尺:测量范围。-2 0 0 m m,精度0.0 2 m m.3.3.4 绞碎机:电动。3.3.5 均质器:不低于 1 0 0 0 0 r/m i n，带均质杯(3 0 0 m L).3.3.6 离心机:不低于 4 0 0 0 r/min.3.3.7 水浴锅:0-6 0 C+1 C。3.3.8 恒温培养箱:(3 5 士L)0C。3.3.9 高压灭菌器。3.3.1 0 其他:玻璃器皿。3.4 测定步骤3.4 门试液制备:准确称取 2 0.0 g 样品于均质杯内，加入 5 0 m L 2 0%甲醇一 二甲氧基甲烷溶液，9 0 0 0 r/m i n，均质 2 m i n，移人离心管 4 0 0 0 r/mi n，离心 1 0 min，将上清液移人1 0 0 mL容量瓶中(视情况过滤)。试样再分别用 2 0%甲醇一 二甲氧基甲烷如上法提取两次，将上清液合并，用甲醇一 二甲氧基甲烷定容至1 0 0 m l。用移 液管吸 取 1 0 m L 提取液至试管中，置于4 0 水 浴，通以氮气吹干，取出 试管，加磷酸盐缓冲液，溶解残渣并定容至 2 m L，作为样液。14.2 菌液的制备:将菌种接种于肉汤培养基(3.2.7)内，置(3 5 士)培养(2 4 士2)h。再转种到菌种培养基(3.2.8)斜面上，置(3 5 士1)培养 1 6 -1 8 h后，加入 3 mL肉汤培养基(3.2.7)，洗下菌苔，吸取1 mL此菌液转种至克氏瓶中菌种培养基(3.2.8)的表面，置(3 5 士)培养(2 4 士2)h。用1 5 mL灭菌生理盐水洗下琼脂表面的菌苔，制成菌悬液，置4 冰箱保存(可保存二周)。3.4.3 菌液用量测定:测试前应先用。.0 5 p g/m L红霉素标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试，经培养后，其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在 1 0 mm以上时，则该菌液浓度即可使用，否则应调 2S x 05 37 一 19 96整菌液至合适的浓度。3.4.4 检定平板的制备:于无菌平皿中加入 1 0 mL融化的测试培养基(3.2.9)，保持水平，待其凝固。再吸取加有菌液的该培养基 4 mL注入上述基层培养基上，保持水平，待其凝固后，在每个平板的表面放置 6 个牛津杯，使牛津杯在半径为 2.8 c m的圆面上成 6 0 0 角间距，所用平板需当天制备。3.4.5 标准曲线的制备 以。.1 0 p g/m l 一 浓度的 标准 工作 液作为 参考浓度。每个标准工作液浓度取3 个检 定平板为 一组，在每个检定平板上的其中3 个牛津杯内加满参考浓度溶液，另3 个牛津杯内加满标准工作液，参考浓度溶液与标准工作液要间隔 放置,5 个标准浓度共 1 5 个检定平板，含量最低的标准浓度0.0 2 5 p g/m L的3个检定平板作为判断阴性结果的对照，其他 1 2 个检定平板用来绘制标准 曲线。这样参考浓度0.1 0 K g/m L 的 工作液将得出4 5 个抑菌圈直径的数值，而其他的标准浓度将得出9 个抑菌圈的 数值。将陶瓦盖盖好，置 3 5 C培养(1 8 士1)h，翻转平板，除去牛津杯，精确地测量产生的抑菌圈直径(精确到0.1 m m)，求出每组3 个检定平板上。.1 0 p g/m L浓度的抑菌圈 直径读数与其他标准浓度的抑菌圈直径读数的平 均值，再求出 参考浓度。.1 0 l g/m L的所有4 5 个抑菌圈直径数值的平均值，用4 5 个参考浓度抑菌圈直径的平 均值与每组中9 个参考浓度 抑菌圈直 径平均值之差来校 正其他各标准 浓度的 抑菌圈读数的平均值。将这些校正后的值，包括。1 0 K g/m L 浓度的平均值在半对数坐标纸上，以 抑菌圈直径为纵坐标(算术级)，以p g/m L 计的 浓度为 横坐标(对数级)，通过式(1)和式(2)的L和H点绘出最佳直线。L=(3 a+2 b+c一 e)/5 。(1)H=(3 e+2 d+c一 a)/5 (2)式中:L 标准曲 线上的 最低浓 度(0.0 5 p g/m L)抑菌圈 直径,m m;H 标准曲 线上的 最高浓 度(0.8 p g/m L)抑菌圈直径，m m;参考浓 度。.1 p g/m L的4 5 个抑菌圈直径的平均值，M M;a,b,d,e 分别表示标准曲线中其他标准浓度(0.0 5,0.2 0,0.4 0,0.8 0 p g/m L)的 抑菌圈直径经校正后的平均值，mm3.4.6 样液的测定 每份样液取 3 个检定平板，在每个检定平板上3个间隔的牛津杯内加满红霉素标准参考浓度溶液，另外 3 个牛津杯内加满被检样液，将陶瓦盖盖好，置 3 5 培养(1 8 士1)6,翻转平板，除去牛津杯，如有抑菌圈产生，精确测量其直径。3.5 结果计算和表述 如样液抑菌圈的直径小于 1 0 mm，即报告为未检出。如抑菌圈的直径大于等于 1 0 m m，经校正后，从标 准曲 线上查出 相应的 红霉素的 含量，得出结果以p g/m l 计。如果样品中 红霉素含量的 单位用m g/k g 表示时，可将p g/m L 按照式(3)进行换算:(3)c一机 一一X式中:X 样品中 红霉素的含量,m g/k g;从标准曲线上查出 的样液红霉素浓度，p g/m L;m 最终试液所代表的试样量，g/m L,注:如测定结果呈阳性，即所显抑菌圈的平均直径大于等于 1 0 mm时，必要时，尚需进行确准试验(可用薄层层析法)。测定低限和回收率测 定低限本方法的测定低限为 0.0 5 m 日k gs x 0 5 3 7 一1 9 9 62 回收率 本方法的回收率数据:红霉素添加浓度为。0 5 u g/g，回收率为7 8.z 7%;红霉素添加浓度为 0.1 0 1 g/g,回收率为8 0.2 8%;红霉素添加浓度为0.2 0 H g/g，回收率为8 6.1 4 Y,oS N 0 5 3 7 一1 9 9 6 附录A(标准的附录)培养墓A 1 肉 汤培养墓 胰酶消化的明 胶5.0 g 酵母浸 膏1.5 g 牛肉 膏1.5 g 氯化钠3.5 9 葡萄 糖L0 g 无水磷酸氢二钾3.6 8 g 无水磷酸二氢钾1.3 2 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 调节溶液 p H到 7。士。.1，分装试管，于 1 2 1 高压灭菌 1 5 m i n.A 2 菌种培养墓 胰酶消化的明 胶6.0 9 胰蛋白 陈的 酶消化物4.0 g 酵母浸膏3.0 g 牛肉 浸膏1.5 g 葡萄糖1.0 g 琼脂1 5.