SBT 10317-1999 蛋白酶活力测定法.pdf

备案号:2 7 4 4-1 9 9 9中 华 人 民 共 和 国 行 业 标 准蛋 白 酶 活 力 测 定/x 1 0 3 17-1 创 冲替ZB X 6 6 0 3 0-8 7Me a s u r e me n t o f p r o t e i n a s e a c t i v i t y本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。福林法 1.1 试剂及溶液:以下试剂都为分析纯 1.1.1 福林试剂(F o l in 试剂:于2 0 O O m L 磨口回 流装置内，加入钨酸钠.(N a p W O,-2 H,O)1 0 0 g,钥酸钠(N a,Mo O,2 H,O)2 5 g,蒸馏水7 0 0 m L,8 5 0 o 磷酸5 0 m L，浓盐酸1 0 0 m L，文火回 流l o h。取去冷凝器，加入硫酸铿(L i 多 0 4)5 馆，蒸馏水5 0 m L,混匀，加人几滴液体澳，再煮沸1 5 m i n，以驱逐残澳及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液 仍有绿色，需要再加几滴澳 液，再煮沸除去之。冷却 后，定容至1 0 0 0 m L，用细菌漏斗 N o 4 5)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2 倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。1.1.2 0.4 mo l 碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(N a,C OO 4 2.4 8，定容至 1 0 0 0 mL,1.1.3 0.4 m o l 三氯乙 酸(T C A)溶液:称取三氯乙 酸(C C L,C O O H)6 5.4 g，定容至1 0 0 0 m L,1.1.4 p H 7.2 磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(N a H 2 P O 4 2 14,0)3 1.跄，定容至1 0 0 0 m L，即成0.2 m o l 溶液(A液)。称取磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H O)7 1.6 3 g，定容至1 0 0 0 m L，即成0.2 m o l 溶液(B液).取 A液 2 8 m L和B液 7 2 m L，再用蒸馏水稀释 1 倍，即成 0.l mo l p H 7.2 的磷酸盐缓冲液.1.1.5 2%酪 蛋 白 溶 液:准 确 称 取 干 酪 素第，称 准 至0.0 0 2 8.加 入0.1 N氢 氧 化 钠l O m L 在 水 浴 中加热使 溶解(必要时用小 火加热煮沸)，然后用p H 7.2 磷酸盐缓冲 液定 容至l O O m L即成。配制后 应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质.1.1.6 1 0 0 p g/m L 酪氨酸溶液:精确称取在1 0 5 烘箱中 烘至恒重的酪氨酸。.1 0 0 馆，逐步加入6 r a L l N盐酸使溶解，用0.2 N盐酸定容至J O O m L，其浓度为1 0 0 0 p g/m L，再吸取此液l O m L,以0.2 N盐酸定容至1 0 0 m L，即配成1 0 0 p g/m L的 酩氨酸溶液。此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。1.2 仪器 a.分析天平:感量 0.l m g;b.5 8 1-G型光电比色 计或7 2 型 分光光度计;c.水浴锅;d.1,2,5,1 0 0 mL移液管等。1.3操作国 欢国内 搜易 局1 9 9 9-0 4-1 5 批准9 9 9-0 4-1 5实施2 3 0S B1 11 璐1 7-1 创冷1.3.1 标准曲线的绘制1.3-1.1 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液(表 1),表 1 配制各种不同浓度的酪氮酸溶液试剂管号123456蒸馏水.L1 0 0 p g/m L酪氨酸，mL酪氨酸最终浓度，p g/m L1 000822 06440466 0288 0 01 01 0 0 1.3.1.2 测定步骤:取6 支试管编号按表1 分别吸 取不同浓度酪氨酸1 m L，各加入0.4 m o 1 碳酸钠5 m L,再各加人已 稀释的福林试剂1 m L。摇匀 置于 水浴 锅中。4 0 保温发色2 0 m i n 在5 8 1-G型光电比色计上分别测定光密度(O D)(滤色片用 6 5 )或用7 2 型分光光度计进行测定(波长6 6 0 n m)。一般测三次，取平均值。将 1 -6 号管所测得的光密度(O D)减去 1 号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净O D数。为了清楚起见，再列出表格如下(表 2),表 2试剂管号123456按表 1 制备的不同浓度酪氨酸，mL1111110.4 mo 1/L N a 2 C 0 m L555555福林试剂，mL111111O D值123平均净OD值0 以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度O D所相当的酪氨酸量K),1.3.2 样品稀释液的制备。1.3-2.1 测定酶制剂:称取酶粉。.1 0 0 g，加入p H 7.2 磷酸盐缓冲液定容至1 0 0 m L，吸 取此液5 m L,再用缓冲液稀释至 2 5 m L，即成 5 0 0 0 倍的酶粉稀释液。1.3.2.2 测定成曲酶:称取充分研细的成曲5 g，加水至1 0 0 m L，在4 0 水浴内 间断搅拌l h，过滤，滤液用0.l m o l p H7.2 磷酸 盐缓冲液稀释到一定倍数(估计酶活力而定)。1.3.3 样品测定:取1 5 X 1 0 0 m。试管3 支，编号1,2,3(做2 只 也可)，每管内加入样品稀释 掖1 mL,置于 4 0 水浴中预热 2 mi n，再各加入经同样预热的酪蛋白 1 mL,精确保温 l O m i n，时间到后，立即再各加入 0.4 m o l 三氯乙酸 2 m L，以终止反应，继续置于水浴中保温 2 0 mi n，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取 1 5 X 1 5 0 m m试管 3 支，编号 l,2,3，每管内加入滤液 1 mL，再加。.4 mo l 碳酸钠5 m L，已稀释的福林试剂1 m L 摇匀，4 0 保温发色2 0 m in 后进行光密 度(O D)测定。2 3 1S B/T 1 0 3 1 7-1 8 1 均 空白试验也取试管3支，编号(1),(2),(3),测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mo l 三氯乙酸 2 mL，使酶失活，再加入酷蛋白。为了清楚起见，分别列出表格于下(见表 3 及表 4),表 3试剂管号试剂管号123(1)(2)(3)预热酶液，mL111预热酶液，mL111预热2%酪蛋白，mL111。.4 m.1 三氯乙酸，mL222作用1 0 min(精确计时)作用l O m i n(精确计时)0.4 m o 1 三抓乙酸，mL222预热 2 写酪蛋白，.L111表 4试剂管号123(1)(2)(3)滤 液.LI111110.4 mo 1 N a 2 C O 3,m L555555福林试剂，mL111111OD值平均OD值净OD值0 样品的平均光密度(OD)一空白的平均光密度(O D)二净OD值。1.4 计算 在 4 0 下每分钟水解酪蛋白产生 l u g 酪氨酸，定义为 1 个蛋白酶活力单位。.、，_，_ 、，、_，_。、A_1砰而重曰附沽刀单仅 l 十量)=;.X 4 X I V X下-;玉 于 .以 少 IU工 1 1 式中:A 由样品测得 O D值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或 O D值XK);4-4 毫升反应液取出 1 m L测定(即 4 倍);N-酶液稀释的倍数;1 0 反应1 0 m i n;W样品水分百分含量。1.5 注意事项 以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶(p H7.2)。若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶，则把配制酷蛋白溶液和稀释酶液用的p H缓冲液换成相应 p H缓冲掖即可。现把几种常用p H缓冲液配方提供如下:1.5.，p H7.5 磷酸盐缓冲液(0.0 2 mo 1/L)称取磷酸氢二钠(N a 2 H P 0,1 2 H 2 0)6.0 2 g和磷酸二氢钠(N a H2 P O,2 H2 0)0.5 g以蒸馏水溶 2 3 2S B胭1 0 9 1 7-1 8 6 8解定容至1 0 0 0 m L e 1.5.2 p H2.5 乳酸一乳酸钠缓冲液(0.0 5 mo l)A液:称取8 0%一9 0%乳酸1 0.6 g，加蒸馏水稀释定容至1 0 0 0 m L o B液:称取7 0 肠 乳酸钠1 6 g，加水稀释定容至1 0 0 0 m L o 取A液1 6 m L与B液1 m L混合稀释一倍即成。1.5.3 p H3.0 乳酸一乳酸钠缓冲液(0.0 5 mo l)A液:称取 8 0%-9 0%乳酸 1 0.6 g，以水定容至 1 0 0 0 mL e B 液:称取7 0%乳酸钠1 6 g,蒸馏水溶解定容至1 0 0 0 m L o 取A液8 m L 与B 液1 m L,混合稀释一倍即成。1.5.4 p H 1 0 硼砂一氢氧化 钠缓冲液 A液:称取硼砂 1 9.0 8 g，用蒸馏水溶解定容至 1 0 0 0 mL(0.0 5 mo l),B液:称取氢氧化钠 8 g，用蒸馏水溶解定容至1 0 0 0 mL(0.2 N),取A液2 5 0 m L,B 液2 1 5 m L 混合，用蒸馏水稀释定容至1 0 0 0 m L即成。1.5.5 p H 1 1.0 硼砂一氢氧 化钠缓冲液 A液:称取硼砂1 9.0 8 g，用蒸馏水定容至1 0 0 0 m L,B液:称取氢氧化钠4 g，用蒸馏水定容至1 0 0 0 m L.取 A液与B液等量混合。1.5.6 2%酪蛋白溶液配成酸性时，须先加数滴浓乳酸，使之湿润以加速其溶解。2 甲醛法 成曲 蛋白 酶活 力的 测 定，如 用 福 林 法 测 是 确 有困 难时，可 用甲 醛法 测 定 作 过 渡。2.1 仪 器_ a.分析天平:感量。.0 1 g;b.水浴锅;c.电烘箱;d.容量瓶、吸管、滴定管等。2.2 试剂与溶液 a.1 写酚酞指示剂;6.0.1 0 o 庸香草酚蓝;c.0.1 N氢氧化钠液、甲 醛(试剂配制法同 氨基态氮的测定，见G B/T 5 0 0 9.3 9-1 9 9 6 氨基态氮测定法 2.3 操作 2.3.1 目测法 称取研细均匀的成曲 样品1 鲍，放人2 5 0 m L锥 形瓶中，加5 5 C 温水8 0 m L,充分摇匀，置于5 5)C水浴锅中保温3 h，取出 后加 热煮沸以破坏酶活力，冷 却后定容至1 0 0 m L，充 分摇匀 后以 脱脂棉 过滤，吸取滤液l O m L，移至1 5 0 m L锥形瓶中，加水5 0 m L,1%酚 酞指示剂。2 m L，以0.1 N氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色(p H 8.2),，记下滴定数作为总酸，继续加甲 醛l o m L，用。.1 N氢氧化钠液滴定至深红色(p H 8.5)为终点，若再加庸香草酚蓝l m L 作指示 剂，则滴至紫红色为 终点。记下滴定数，减去空白 数后计算成氨基态氮。另称取曲l o g 做水分，再折算 成干基数。2.3.2 酸度计法 所 用 仪 器、药 品、操 作 方 法 等 与 氨 基 态 氮 测 定 法 同(见G B i T 5 0 0 9.3 9-1 9 9 6)o 2.4 计算2 3 3习 BI T 1 0 3 1 7-1 9 8 9蛋白酶活力(克氨基态氮/1 0 0 9)(干基)(V-Vo)XN X0.0 1 4l o x_1 01 0 0又 _ 1 0 0X l-W ”一(2)式中:V加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数，mL;Vo.甲醛空白滴定数，mL;W曲水分，%;N-氢氧化钠标准溶液的当量数，N;0.0 1 4氮的毫克当量数。附加说明:本标准由国家 国内 贸 易!局提出。本标准由上海市酿造科学研究所起草。本标准主要起草人须凤高。本法 实质 上是在一 定温度 下、一定时 间内，成曲利 用 自身的蛋 白酶把 自身原料 中的蛋 白质水解 成氨 基酸。以测 定氨基 态氮的橄 来衡量蛋白酶活力的数值.在培养和堆放过程.环境温度和自身含有水分，故已有少量氮基酸生成。为了能