NYT 555-2002 动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法.pdf

I C S 1 1.2 2 0s4 1中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准N Y/T 5 5 5-2 0 0 2动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法D e t e c t i o n me t h o d s f o r c o l i f o r m g r o u p,f a e c a l c o l i f o r m g r o u p，c o l i f o r m b a c t e r i a i n a n i ma l p r o d u c t s2 0 0 2 一 0 8 一 2 7发布2 0 0 2 门 2 一 0 1实施中 华 人 民 共 和 国农 业 部发 布4 3 1N Y/T 5 5 5-2 0 0 2前言 大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌是食品卫生的三项重要的卫生指标。当前国际上采用的方法有美国公职分析化学家协会(A O A C)方法及日 本人介绍的煌绿乳糖胆盐肉汤(B G L B)和E C试管发酵法。为满足要求，依照日 本采用的B G L B和E C试管发酵法并进行适当改进，建立了本检测方法。本方法用B G L B发酵管检测大肠菌群并计算最大可能数(MP N)值，用E C肉汤发醉管检测粪大肠菌群并计算MP N值，在检测粪大肠菌群的基础上通过生化鉴定检测大肠杆菌并计算MP N值，鉴定中省去了革兰氏染色。这些重要改进缩短了检验时间，简化了操作程序，而且经对比试验证明结果可靠，适合于动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。本标准的附录A是规范性附录，附录B是资料性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:天津动植物检疫局。本标准主要起草人:秦贞奎、张碧波、侯艳梅、杨金良、薛振源。N Y/T 5 5 5-2 0 0 2动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群 和大肠杆菌的检测方法1 范围本标准规定了动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法。本标准适用于动物产品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准2.1 大肠菌群c o l i f o r m s;c o l i f o r m g r o n p 一群能分解乳糖产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆茵。2.2 粪大肠菌群 f a e c a l c o l i f o r m s;f a e c a l c o l i f o r m s g r o n p 4 4.5 C 发酵乳糖产气的一群细菌，是用来表示来源于粪便的大肠菌群。2.3 大肠杆菌e s c h e r i c h i a c o l i;c o l i f o r m b a c t e r i a 符合大肠菌群和粪大肠菌群定义，用I MV i c(靛基质、甲基红、维培和西蒙氏柠檬酸盐)生化试验进一步鉴定，四种生化反应结果依次为+一一和一+一一的细菌。2.4 最大可能数m o s t p r o b a b l e n u m b e r,MP N 采用多次稀释方法所求得的最近似数，是通过概率计算出来的。2.5 I MV i C 靛基质试验、甲基红试验、维培(V P)试验和构椽酸盐利用试验的缩写。3 检测方法3.飞 材料准备3.1.1 仪器 吸管，恒温水浴箱，培养箱，匀浆器，1 0 0 m 1.,2 0 0 m L和5 0 0 m L三角瓶及广口瓶，直径5 m m的玻璃珠。3.1.2 培养基及试剂 配制方法见附录A(规范性附录)。31.2.1 煌绿乳糖胆盐肉汤(B G L B),配制方法见第 A.1 章。3.1.2.2 E C肉汤，配制方法见第A.2 章。3 门.2.3 伊红美蓝琼脂(E MB)，配制方法见第A.3 章。3.1.2.4 甲基红一 维培(MR-V P)培养基，配制方法见第A.4 章。3.1.2.5 西蒙氏柠檬酸盐培养基，配制方法见第A.5 章。N Y/r 5 5 5-2 0 0 23.1.2.6 靛基质(“引 噪)试验培养基，配制方法见第 A.6 章。3.1.2.7 科瓦克(K o v a c s)氏靛基质试剂，配制方法见第 A.7 章3 门.2.8 甲基红指示剂，配制方法见第A.8 章。3.1.29 维培(V P)试剂，配制方法见第 A.9 章。3.2 检测程序 本标准的检测程序见图1.，图1 检 测程序流程图3.3 样品制备3.3.1 无菌操作从动物产品中采取有代裹性的样品 如有包装则用 7 5%乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检测，应将冷冻样品置于一1 5 冰箱保存。非冷冻而易腐的样品，应置于4 冰箱保存。检测前冷冻样品可于2 一一5 下在1 8 h内，或于4 5 下在1 5 m i n内 解冻。13.2 不同样品匀浆液的制备3.3.2.1 液体样品:以无菌吸管取样2 5 m L加人到装有2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)内，制成 1:1 0 的样品匀浆。3.3-2.2 固体和半固体样品:以无菌操作取样 2 5 g，加人到装有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌匀浆器内，于8 0 0 0 r/m i n 均浆2 m i n，制成1:1 0 样品匀浆(也可用灭菌乳钵研磨的方式代替)。N Y/T 5 5 5-2 0 0 23.3.2.3 样品稀释液的制备:根据样品污染情况，用灭菌生理盐水将样品匀浆制成一系列十倍递增的样品稀释液(通常采用 1 0-,1 0-1 和1 0-稀释)。从制备样品匀浆至稀释完毕，全过程不得超过 1 5 m i n e3.4 大肠菌群的测定3.4.1 大肠菌群MP N值的测定3.4.1.1 每个样品通常选用 1 0-1,1 0-2 和1 0-3 三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管B G L B(见第A.1 章)，每管接种1 m L，每接种一个稀释度换一支无菌吸管。3.4.1.2 将接种管置于(3 6 士1)培养2 4 h,3.4.1.3 观察试管的产气情况:检查管内是否有气泡产生，并记录2 4 h内产气的B G L B管数。如所有培养管均未产气，则报告大肠菌群阴性;如有产气管，进一步试验证实。3.4.2 大肠菌群的证实试验3.4.2.1 将所有产气管中的培养物用接种环接种到伊红美蓝琼脂平板，(3 6 士1)培养2 4 h,3.4.2.2 大肠菌群在伊红美蓝琼脂平板上生长，其菌落为有金属光泽、黑紫色或紫色带黑心。3.4.2.3 查有金属光泽、黑紫色或紫色带黑心菌落的B G L B产气管数及其稀释倍数。3.4-2.4 结果报告:按3.4.2.3 检查结果，查M P N检索表(见附录B)，报告大肠菌群的M P N/g(m L)值。3.5 粪大肠菌群测定3.5.1 粪大肠菌群MP N值的侧定3.5.1.1 每个样品通常选用1 0-,1 0“和i 0-，三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管E C肉汤，每管接种 1 mL e15.1.2 将所有接种的E C肉汤管于 3 0 m i n内置于温度为(4 4.5 士。.5)的带盖水浴箱内，培养(2 4士2)h。水浴箱的水面应高于肉汤培养基液面。用4 4.5 产气阳性的大肠杆菌和4 4.5 不产气的大肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。3.5.1.3 记录E C管的产气情况。E C肉汤管都不产气为粪大肠菌群阴性，产气为粪大肠菌群阳性。将产气管作证实试验。3.5.2 证实试验3.5.2.1 将产气管接种伊红美蓝平板在(3 6 士1)C 培养2 4 h.3.5-2.2 查有金属光泽、紫色带黑心菌落的E C产气管数及其稀释倍数。3.5-2.3 结果报告:按3.5.2.2 结果，查MP N检索表(见附录B)。报告粪大肠菌群的MP N/g(m L)值。3.6 大肠杆菌测定 3.6.1 培养 将 3.5-2.1 中伊红美蓝平板上典型大肠杆菌菌落接种到营养琼脂平板，在(3 6 土1)培养 1 8 h-2 4 h。每个平板至少挑选2 个菌落。3.6.2 生化试验 挑取上述菌落纯培养物接种3.6.3 生化培养基和乳糖发酵管，(3 6 士1)0C 培养2 4 h 后观察结果。3.6.33.6.3.1大肠杆菌与非大肠杆苗鉴别试验方法 靛基质试验:滴加K o v a c s 氏靛基质试剂0.1 m L于靛基质试验培养基中混合，静置，观察结果。出现红色环的为反应阳性;出现黄色环的为反应阴性。甲基红(MR)试验:滴加甲基红指示剂0.2 m 1于MR-V P培养基中混合，观察结果。出现红色为阳性反应;出现黄色为阴性反应。维培(VP)试验:滴加V P试剂甲液 0.2 m L于MR-V P培养基中混匀，再滴加V P试剂乙液。.1 m L混匀，静a)b)3.6-3.2 a)b)3.6.3.3 a)N Y/T 5 5 5-2 0 0 2 置，观察结果。b)在1 5 m i n内出现红色的为阳性反应;无颜色变化的为阴性反应。阴性结果 1 h后再观察一次 出现红色也为阳性反应。16.3.4 西蒙氏柠檬酸盐试验:观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应;不变色为阴性反应。16.4 大肠杆菌鉴定结果 应符合表 1 要求。表，大肠杆菌鉴定结果靛基质M RVP西蒙氏柠像酸盐鉴定(型别)+典型大肠艾希氏杆菌非典型大肠艾希氏杆菌一 卜+十典型柠像酸盐杆菌非典型柠橄酸盐杆菌十+十典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌 如出现表1 以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。3.6.5 结果报告 1 MV i c试验结果为+一一、一+一一和乳糖发酵管产气者，查其E C肉汤产气管数及其稀释倍数，对照附录 B(资料性附录)中 MP N检索表报告样品中大肠埃希氏杆菌 MP N/a(mL)值N Y/T 5 5 5-2 0 0 2 附录A (规范性附录)培养墓和试荆配制方法，煌绿乳精胆盐肉汤(B G L B)1 成分蛋 白脉孚 L 糖牛胆盐煌绿水溶液蒸馏水AA1 0.0 g2 0.0 g1 0.0 g1 3.3g1 0.0 m1A.1.2 配制方法 将蛋白 陈、乳糖溶于约5 0 0 m L 蒸馏水中，加人牛胆盐后用蒸馏水稀释到9 7 0 m L,调p H 7.4。再加入。.1 0 0 煌绿水溶液 1 3.3 mL，用蒸馏水补足到 1 0 0 0 mL。分装到 2 0 X 1 5 0 m m试管中(管内有倒立的小发酵管)。每管 1 0 m L。于1 1 2 k P a 灭菌 1 5 m i n，最终p H(7.2 士0.1)0A.2A-2E C肉汤A.21 1 21 成分胰蛋白 脉或酪蛋白 胰消 化物2 0.0 g3 号胆盐或混合胆盐1.5 g乳糖5.0 g磷酸氢二钾(K 2 H P O,)4.0 g磷酸二氢钾(K H 2 P O,)1.5 g抓化钠5.0 g蒸馏水1 0 0 0 mL2 配制方法将以上成分溶解于燕馏水中，分装 1 6 X 1 5 0 m m试管(试管内有倒立的小发酵管)，每管 8 m 1，于k P a 灭菌1 5 m i n，最终p H(6.9 士0.ll,3 伊红美蓝琼脂(E MB)3.1 成分 蛋白陈 伊红 Y 乳糖 美蓝 磷酸氢二钾 琼脂 蒸馏水AA1 0.0 g0.4 g(或2%水溶液2 0 m L)1 0.0 g0.0 6 5 g(或0.5%水溶液1 3 m L)2.0 g1 5.0 g1 0 0 0 mLA.3.2 配制方法 将蛋白陈、磷酸盐和琼脂加到 1 0 0 0 m L蒸馏水中，并加热使其溶解。并分装于三角瓶中。每瓶1 0 0 m l 或2 0 0 m L,7 5 k P a 灭菌1 5 m i n，最终p H(7.1 士0.2)。使用前将琼脂溶化，于每1 0 0 m 1，琼脂中N Y/r 5 5 5-2 0 0 2加5 m L 灭菌的2 0%乳糖水溶液，2 mL的2%伊水溶液和 1.3 mL 0.5%的美蓝水溶液，摇匀，冷至4 5-5 0 C后倾注平皿。A.4 MR-V P培养基A.4.1 成分 胰陈7.