NYT 3464-2019 牛泰勒虫病诊断技术.pdf

NY/T3464-2019牛泰勒虫病诊断技术1范围本标准规定了环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫的检测技术及其所引起的牛泰勒虫病的诊断技术要求。本标准适用于牛泰勒虫病病原检测及急性临床病例的诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语下列缩略语适用于本文件。PBS:磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)4材料与试剂4.1试剂4.1.1除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。4.1.2姬姆萨(Giemsa)染色液原液（见附录A中的A.1)。4.1.3姬姆萨染色液工作液（见A.2)。4.1.4甲醇。4.1.5香柏油。4.1.62 XPremix Taq酶混合液（商用）：包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物。4.1.7无RNase水。4.1.8全血基因组提取试剂盒。4.1.9琼脂糖（电泳级）。4.1.101TAE(见A.3).准信息服4.1.1110mg/mL溴化乙锭(EB)或同类核酸染料（见A.4)。4.1.12环形泰勒虫阳性对照（用环形泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/l)。4.1.13瑟氏泰勒虫阳性对照（用瑟氏泰勒虫感染牛，染虫率达到5%以上时，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/L)。4.1.14泰勒虫阴性对照（筛选泰勒虫阴性牛，提取血液基因组DNA,稀释至1ng/uL)。4.2耗材4.2.1载玻片。4.2.2抗凝真空采血管。4.2.3剪毛剪。4.2.41.5mL无菌离心管。NY/T3464-20194.2.5200LPCR管。4.3仪器4.3.1光学显微镜（含100物镜）。4.3.2PCR扩增仪。4.3.3核酸电泳系统。4.3.4凝胶成像仪4.3.5单道微量移液器(1L10L:10L100L:100L1000L)。4.36高速离心机。5生物安全要求食梦的相关规定执行。6临床诊断6.1典型临床症状6.1.16.1.2视黏膜黄6.1.3浅表淋巴坚硬6.1.4贫血尿色淡黄或6.2典型病理变6.2.1血液凝盾下有胶样润，空黄色。黏膜和浆膜黄染可见出血点06.2.2体表淋巴程度种大、面灰黄色.髓质有面蒸C参见附家书中的6.2.3皱胃黏膜肿胀有头至大的货有色或暗红色结节结节部糜或溃疡（参见B2)。6.3流行特点26.3.1多发于4月(分布区m6.3.2患病动物体表可少6.3.31岁3岁牛的临床症状。6.4结果判定牛只出现6.1和6,2的变化为疑件泰勒虫7血涂片显微镜检查7.1血涂片制备用剪毛剪剪除牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖，挤取一滴耳尖静脉血于玻片上，用推片推成有末梢的薄血涂片，并迅速晾干。7.2血涂片固定加3滴甲醇于血涂片上进行固定，晾干后重复一次。7.3血涂片染色将姬姆萨染液工作液滴加到甲醇固定好的血涂片上，室温染色30mi后，用自来水充分冲洗掉残留的染色颗粒，吹风机吹干或自然晾干后待检。7.4显微镜检查血涂片上滴加一滴香柏油，在1000倍(10100)光学显微镜下观察100个视野。7.5结果判定7.5.1阳性：红细胞内观察到泰勒虫典型虫体时，可确诊（参见附录D)。2NY/T3464-20197.5.2疑似：红细胞内未见典型虫体，仅观察到少量点状或不规则形颗粒，判定为疑似感染。7.5.3阴性：未出现7.5.1和7.5.2的结果，判定为血涂片检测阴性。8环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫PCR检测方法采用多重P方法从待检牛血液基因组中检测环形泰勒虫COB特异性基因片段和瑟氏泰勒虫转录间隔区(ITS)特异性基因片段。8.1病原DNA制备采集待检牛颈静脉抗凝血，用商品化的血液基因组DNA提取试剂盒提取虫体DNA,提取步骤按照说明书进行。提取好的虫体DNA立即进行PCR扩增或一20保存备用。8.2PCR反应操作方法8.2.1反应体系按照附录E,用引物AnCb-F/AnCb-R和SerITS-F/SerITS-R(见附录F)组合配置PCR反应体系，反应体系为25L。环形泰勒虫阳性对照模板为4.1.12所列环形泰勒虫DNA2L;瑟氏泰勒虫阳性对照模板为4.1.13所列瑟氏泰勒虫基因组DNA2L;阴性对照模板为4.1.14所列泰勒虫阴性感染牛血液基因组DNA2L。8.2.2PCR反应条件反应体系配置并混匀后，置于PR仪内进行扩增。扩增程序为：95预变性5min;94变性1min,61.5退火50s,68延伸1min,共35个循环；68延伸10min.8.2.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳及成像用1TAE缓冲溶液配制1.5%琼脂糖凝胶，取PR产物10L在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统观察结果并拍照。8.2.4质控标准环形泰勒虫阳性对照出现393bp、瑟氏泰勒虫阳性对照出现818bp的特异性条带，阴性对照无扩增条带时，判为实验有效。8.3结果判定8.3.1阳性与DNA标准分子量比对，当样品出现大小为393bp扩增片段时，判定为环形泰勒虫核酸阳性：当样品扩增片段大小为818bp时，判定为瑟氏泰勒虫核酸阳性（见附录G)。8.3.2阴性样品无特异性的阳性扩增条带出现，判定为环形泰勒虫和瑟氏泰勒虫核酸阴性。9综合判定9.1阳性同时出现6.1,6.2,6.3，同时出现7.5.1或8.3.1，判定为泰勒虫病阳性。9.2隐性感染未出现6.1、6.2和6.3，但出现7.5.1或8.3.1时，判定为泰勒虫隐性感染。9.3阴性未出现6.1、6.2和6.3，同时出现7.5.3和8.3.2时，判定为牛泰勒虫病阴性。3