细胞基本培养技术.ppt

内内 容容 第一节第一节 玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒 第二节第二节 培养操作的基本要领和要求培养操作的基本要领和要求 第三节第三节 细胞培养的基本技术细胞培养的基本技术 第一节第一节 细胞培养所用玻璃及塑料细胞培养所用玻璃及塑料 制品的清洗与消毒制品的清洗与消毒 一、清洗一、清洗 目的：目的：在组织细胞培养中，体外细胞对任何在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害有害物质物质都非常敏感都非常敏感,均能影响培养细胞的生长均能影响培养细胞的生长 有害物质包括有害物质包括：微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物 上次细胞残留物上次细胞残留物 非营养成分的化学物质非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品需要清洗的培养用品 玻璃器皿、胶塞、塑料制品玻璃器皿、胶塞、塑料制品 1 1、玻璃器皿的清洗、玻璃器皿的清洗 包括包括浸泡、刷洗、浸酸浸泡、刷洗、浸酸和和冲洗冲洗四个步骤四个步骤 清洗后的玻璃器皿要求：清洗后的玻璃器皿要求：干净透明无油迹干净透明无油迹 不能残留任何物质不能残留任何物质 清洗：自来水洗，烘干清洗：自来水洗，烘干 泡酸泡酸 自来水洗自来水洗 去离子水洗去离子水洗 三蒸水洗三蒸水洗 烘干烘干 新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌新瓶子均按该程序清洗，培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸液（洗液）：浓硫酸酸液（洗液）：浓硫酸+重铬酸钾重铬酸钾 浸泡：浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。掉。新的初次使用的玻璃器皿新的初次使用的玻璃器皿 先用自来水简单刷洗，然后用先用自来水简单刷洗，然后用5稀盐稀盐酸液浸泡过夜酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质，以中和其中的碱性物质 培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后上高压！上高压！再次使用的玻璃器皿：再次使用的玻璃器皿：用后立即浸入水中，要求完全用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液浸入，不能留有气泡或浮在液面上。面上。原因：常附有大量刚使用过的蛋白原因：常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉。质，干固后不易洗掉。刷洗：刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 浸酸：浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程 注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器注意：浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 6 小时小时 配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，配制、浸泡时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。并要保护好面部及身体裸露部分。冲洗冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。浸泡后的冲洗过程：浸泡后的冲洗过程：需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗蒸馏水浸泡过夜，自来水冲洗5 5遍，一蒸水遍，一蒸水5 5遍，遍，二蒸水二蒸水3 3遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备遍，培养瓶要求二蒸水也用流水，烤干备用。用。2 2、胶塞的清洗、胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理用自来水冲洗，再做常规处理.常规清洗方法常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 或洗或洗衣粉煮沸衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用。次，晾干备用。3 3、塑料制品的清洗、塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用必要时用2%NaOH 2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用冲洗，再用5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡30 30 分钟，最后分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中干燥！烤箱中干燥！二、包装：二、包装：目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消目的：以便消毒及储存，防止落人灰尘及消毒后再次被污染。毒后再次被污染。包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物包装纸（盒）表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等！品名称、消毒日期等！各种用品的包装各种用品的包装 器皿的包装分为半包装和全包装器皿的包装分为半包装和全包装 培养瓶培养瓶 两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。两个一组全包，包装前盖上螺旋盖子。吸管吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。青霉素小瓶青霉素小瓶 倒扣在饭盒中，全包。倒扣在饭盒中，全包。滤器滤器 上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。上下口半包装再用报纸包，最后用布包好。大的容器大的容器 如锥形瓶，加上棉塞后半包装。如锥形瓶，加上棉塞后半包装。枪头、枪头、EPEP管管 装在相应的盒子中，全包。装在相应的盒子中，全包。手术器械手术器械 放在饭盒中，全包。放在饭盒中，全包。离心管离心管 加盖子后全包加盖子后全包 三、消毒、灭菌三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过防止培养物污染可通过消毒灭菌（将已存在的微消毒灭菌（将已存在的微生物去除）生物去除）灭菌灭菌sterilization：应用理化方法杀死所有病原微应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。生物、非病原微生物和芽胞。消毒消毒disinfection：应用理化方法杀死微生物，只应用理化方法杀死微生物，只要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。要求达到无传染性的目的，不要求全部杀死。无菌无菌germ free：没有活菌。：没有活菌。防腐防腐antisepsis：应用理化方法防止和抑制微：应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。生物生长繁殖。抑菌（抑菌（bacteriostasis）：）：抑制体内或体外细抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素 1、消毒灭菌的方法消毒灭菌的方法 物理方法物理方法:湿热（高压蒸汽）、湿热（高压蒸汽）、干热、干热、紫外线。紫外线。射线、过滤、射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。离心沉淀等方法杀灭或去除微生物。化学方法化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。物。2、消毒灭菌的注意事项、消毒灭菌的注意事项 干热消毒：干热消毒：一般在烤箱中进行，需加温到一般在烤箱中进行，需加温到 160160，保持保持9090120 min120 min方能杀死芽孢。方能杀死芽孢。注意！注意！消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免冷空气突然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外然进人，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。事故。湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行湿热消毒：一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。消毒。注意：注意：1、不能装太满，保持消毒器内气体流通。、不能装太满，保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前，打开排气阀门，使加热在加热升压之前，打开排气阀门，使加热后消毒器内的残留冷空气排出！后消毒器内的残留冷空气排出！关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的关闭排气阀门，开始升压，待达到所需要的压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。压力时，开始记录时间，并控制压力恒定。3、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒、一般物品：布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是的要求是 15磅磅 20 min；常规使用液体：消毒常规使用液体：消毒 15磅磅 15 min。4、橡胶和塑料用品橡胶和塑料用品 ：如滤器、如滤器、EPEP管、离心管等高压管、离心管等高压1010磅磅15 min15 min。紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作紫外线消毒：主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为台表面及桌椅等消毒。时间为3030分钟分钟2 2小时左右。小时左右。过滤除菌消毒：过滤除菌消毒：适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。3、常用设施的消毒及灭菌、常用设施的消毒及灭菌 培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸培养室：紫外线照射、乳酸熏蒸 台面：紫外线照射、台面：紫外线照射、70%乙醇擦拭乙醇擦拭 培养箱：新洁尔灭擦拭培养箱：新洁尔灭擦拭 培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽培养瓶、培养皿等：用报纸包好高压蒸汽灭菌灭菌 滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸滴管、枪头等：装载相应的容器中用报纸包好高包好高 压蒸汽灭菌压蒸汽灭菌 培养板：紫外线照射培养板：紫外线照射12小时以上。小时以上。培养基：过滤除菌培养基：过滤除菌、第二节第二节 培养操作基本要领和要求培养操作基本要领和要求 防止污染是决定培养成功或失败的首要条件防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备一、培养前准备 1、制定出分门别类的操作卡片、制定出分门别类的操作卡片。如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和器材和物品名称、要求及数量等，物品名称、要求及数量等，好处是实验者可按卡好处是实验者可按卡片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操片收集所用物品，清点无误后，把用品放置于操作场地，然后进行消毒。作场地，然后进行消毒。2、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果、操作野消毒：现多用紫外线灯灭菌，效果很好。很好。用用30 瓦紫外线管灯，操作箱消毒瓦紫外线管灯，操作箱消毒20 一一30 分钟即可；操作室空间大，需消毒分钟即可；操作室空间大，需消毒3050 分钟。分钟。在用紫外线灯照射期间，在操作台面上在用紫外线灯照射期间，在操作台面上勿置勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多紫外线只有直接杀菌作用，工作野用品过多或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消或重叠放置，物品相互遮挡射线，会降低消毒效果毒效果 3、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在、洗手和着装：原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱利用无菌箱工作时，因整个前臂要伸入箱内，洗刷时一定要清洗到肘部。内，洗刷时一定要清洗到肘部。75酒精，酒精，进行擦洗消毒；必要时亦可用进行擦洗消毒；必要时亦可用0.2的新洁的新洁尔灭洗涤消毒。尔灭洗涤消毒。进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口进行培养工作时，如利用净化台，仅戴口罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌罩和工作帽，着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。室内工作需着消毒衣帽。二、火焰消毒：二、火焰消毒：在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作，如安装吸管安装吸管帽、启开或封闭瓶口等，都需经