NYT 2417-2013 副猪嗜血杆菌PCR检测方法.pdf

NY/T2417-2013副猪嗜血杆菌PCR检测方法1范围本标准规定了检测副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)的聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction,PCR)技术本标准适用于副猪嗜血杆菌病的病原学检测。2材料准备2.1器材PCR扩增仪、1.5mL离心管、2.0mL离心管、0.2 mL PCR反应管、水浴箱、台式高速温控离心机、电泳仪、移液器、移液器吸管、紫外凝胶成像仪、冰箱。2.2试剂NET缓冲液（配制方法参见A.l)、TAE电泳缓冲液（配制方法参见A.2)、RNase A酶、蛋白酶K、Tag DNA聚合酶(5U/L)、l0XPCR缓冲液（含Mg+)、脱氧三磷酸核苷酸混合液(dNTPs,各2.5mmol/uL)、125 bpDNA分子质量标准、无水乙醇、酚一氯仿一异戊醇(25：24：1)、三羟甲基氨基甲烷(Tis碱)、琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠(Na2 EDTA)、冰醋酸、氯化钠、溴酚蓝、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠(SDS)、灭菌超纯水。2.3引物引物序列：F1:5-TAT CGG GAG ATG AAA GAC-3;F2：5-GTA ATG TCT AAG GACTAG-3;Revx:5-CCT CGC GGC TTC GTC-3。引物在使用时用灭菌超纯水稀释为20umol/L。靶基因片段序列及引物在靶基因中的位置参见A.3。2.4样品采集2.4.1气管分泌物用灭菌棉拭子蘸取气管分泌物，放入无菌试管中。2.4.2肺脏无菌采集肺脏病变部位或病变/非病变部位交界处的样品。2.4.3关节液若有关节囊肿，在囊肿部位表面常规碘酊消毒，用2mL或5mL灭菌注射器穿刺，无菌吸取1mL2mL关节渗出液。2.4.4采集的样品应在4条件下立即送到实验室。2.5DNA提取2.5.1样品处理2.5.1.1气管分泌物拭子将每支拭子浸人1mL2 mL NET缓冲液中30min,反复挤压。将浸出液经47500g离心15min后，弃上清。收集沉淀，用1 mLNET缓冲液重悬。2.5.1.2肺组织将肺组织样品剪碎，按1g加入0.9LNET缓冲液研磨后，用双层灭菌纱布过滤。收集过滤液于2mL灭菌离心管，47500g离心15min,弃上清。收集沉淀，用1 mLNET缓冲液重悬。1