NYT 3234-2018 牛支原体PCR检测方法.pdf

NY/T3234-20184.2样品处理取0.5g待检样品（肺脏）于已洗净、灭菌并烘干的匀浆器中充分研磨，加10mL灭菌生理盐水混匀，反复冻融3次，3000r/min离心l5min。取上清液转入无菌的1.5 mL Eppendorf管中，编号备用。PCR试验中阳性对照样品使用3.4中的牛支原体菌液培养物。样本在28条件下保存应不超过24h。若需长期保存，应放在一70冰箱或液氮中，但应避免反复冻融。5操作方法5.1基因组DNA的提取在样本制备区进行，有关生物安全和防止交叉污染的措施见附录B。使用市售的DNA提取试剂盒提取组织、培养物种的DNA,具体操作参照试剂盒说明。5.2PCR反应所用引物使用3.3中配制好的引物溶液。5.3PCR反应体系及反应条件配置PCR反应体系在反应混合物配制区进行；加样在样本处理区进行。PCR体系如下所示：10XPCR Buffer(Mg2+free)2.5L25 mmol/L MgCl22.0uL2.5 mmol/L dNTPs2.0L上游引物(10mol/L)0.5L下游引物(10mol/L)0.5uL5U/L rTag DNA聚合酶0.5L模板DNA2.0uL补ddH2O至总体积(Total)25.0L瞬时离心，置PCR扩增仪内进行扩增。95预变性5min;循环9530s,5230s,72120s,30个循环后72延伸10min。5.4产物检测使用0.8%琼脂糖凝胶在含有染料(EB或其替代物)的TAE缓冲液中进行电泳，在紫外观察仪或者凝胶成像系统观察结果。6结果判定6.1试验成立的条件标准阳性样品扩增出1.9kb片段而空白对照不能扩增出任何条带，则PCR反应判定为试验成立；如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段，或空白样品和标准阴性样品扩增出目的片段，则试验不成立。6.2检测结果判定符合6.1的条件下，待检样品扩增出的DNA片段为1.9kb,可判定待检样品为牛支原体核酸阳性；未出现1.9kb的DNA片段，则可判定待检样品为牛支原体核酸阴性。PCR检测结果判定标准图例见附录C。若需进一步确定，可对PCR产物进行测序。2