NYT 2841-2015 猪传染性胃肠炎病毒RT-nPCR检测方法.pdf

NY/T2841-20154.12无RNA酶超纯水。4.131.5%琼脂糖：配方见A.3。4.14电泳缓冲液(TAE):配方见A.4。4.15样品处理液：配方见A.2。4.16阳性样品：参见C.1。4.17阴性样品：参见C.2。5仪器设备5.1高速冷冻离心机：要求最大离心力在12000g以上。5.2PCR扩增仪。5.3核酸电泳仪和水平电泳槽。5.4恒温水浴锅。5.528冰箱和一18冰箱。5.6微量加样器(0.5L10L,2L20L,20L一200L,100L.1000L)。5.7组织研磨器或研钵。5.8凝胶成像系统（或紫外透射仪）。6样品的采集、运输和处理6.1样品采集和运输宜采集腹泻急性期的小肠或新鲜粪便。采集小肠(5cm10cm)或新鲜粪便(5g10g),置于样品密封袋中，在低温保存箱中送实验室，应确保样品到实验室时附带的冰袋未完全融化；如不能及时检测，应将样品置于低于一18冰箱中保存。6.2样品处理6.2.1小肠样品取1cm3cm小肠组织，用剪刀剪碎，加入10mL的PBS。用组织研磨器研磨后反复冻融3次，经12000r/min离心5min,取上清备用。6.2.2粪便样品取0.5gl.0g新鲜粪便，加入800uL样品处理液。反复冻融3次，经12000r/min离心5min,取上清备用。6.2.3细胞培养物样品取细胞培养物300L500L,无需任何处理，备用。7RNA的提取下列方法任选其一。在提取RNA时，应设立阳性对照样品和阴性对照样品，按同样的方法提取RNA。RNA的提取宜在无RNA污染的外排式生物安全柜中进行。a)Trizol法。按照生产厂家提供的操作说明进行，步骤如下：取250L上清作为待提取样品。加人750 uL Trizol,振荡混匀后，室温放置5min。加入氯仿250uL,振荡混匀后，室温放置5min15min,412000r/min离心15min。取上层水相400L500uL,加入等体积的异丙醇，混匀，一20放置2h以上或-80放置0.5h,412000r/min离心10min。去上清，缓缓加入75%乙醇（用DEP水配制）1.0ml洗涤，412000r/min离心5min。去上清，室温干燥20min,加入DEPC水20L,使充分容解。