NY 410-2000 根瘤菌肥料.pdf

N Y 4 1 0-2 0 0 0前言 本标准在原有标准N Y/T 2 2 7-1 9 9 4 微生物肥料 的基础上，对其中的根瘤菌肥料部分进行修改 主要修改内容如下:增加定义、抽样和判定规则部分;增加菌种部分，包括菌种有效性、菌体特性特征、菌落形态;删除成品无害化指标。因为根瘤菌肥料一般以 草炭为载体，而且每公顷每年仅用7 5 0 7 5 0 0 g根瘤菌肥拌种，不存在重金属的危害。草炭经高温灭菌后，大肠菌群和蛔虫卵不再存活。本标准自实施之日 起，同时代替 N Y/T 2 2 7-1 9 9 4中的根瘤菌肥料部分。本标准的附录A为标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位:农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。本标准主要起草人:宁国赞、刘惠琴、马晓彤、葛诚、李俊。中华人民共和国农业行业标准根 瘤 菌 肥 料N Y 4 1 0-2 0 0 0Rh i z o b i u m f e r t i l i z e r1 范围 本标准规定了豆科根瘤菌肥料的分类、技术要求、检验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存。本标准适用于以共生固氮性能优良的根瘤菌菌株为生产用菌 经液体发酵生产而成的根瘤菌液体肥料，菌液以持水性能良好的载体为吸附剂制成的根瘤菌固体肥料;也适用于以根瘤菌为主的含有能促进结瘤、固氮作用的芽胞杆菌、假单胞菌或其他有益的促生细菌制成的复合根瘤菌肥料。2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为 有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 6 5 4 3-1 9 8 6 瓦楞纸箱 N Y 4 1 1-2 0 0 0 固氮菌肥料3 定义 本标准采用下列定义。3.1 根瘤菌肥料 用于豆科作物接种，使豆科作物结瘤、固氮的接种剂。3.2 复合根瘤菌肥料 以根瘤菌为主，加人少量能促进结瘤、固氮作用的芽胞杆菌、假单胞细菌或其他有益的促生微生物的根瘤菌肥料，称为复合根瘤菌肥料。加人的促生微生物必须是对人畜及植物无害的菌种。4 产品分类4 门按形态不同，分为液体根瘤菌肥料和固体根瘤菌肥料。42 以寄主种类的不同，分为菜豆根瘤菌肥料、大豆根瘤菌肥料、花生根瘤菌肥料、三叶草根瘤菌肥料、豌K i 根瘤菌肥料、首楷根瘤菌肥料、百脉根根瘤菌肥料、紫云英根瘤菌肥料和沙打旺根瘤菌肥料等5 技术要求5 门菌种5嘴 门菌种的有效性 用于 生产根瘤菌肥料的菌种系属于根瘤菌属(R h i z o b i u m),慢生根瘤菌属(B r a d y r h i z o b i u m),固氮根瘤菌(A z o r b i z o b i“二)、中慢生根瘤菌(Me s o r h i z o b i u m)等各属中的不同的根瘤菌种，这些菌种必须是经过鉴定的菌株，或有二年多点田向试验获得显著增产的菌株 该菌种必须在菌肥生产前一年内经无氮营荞液盆栽接种试验鉴定，结瘤固氮性能优良，接种植株干重比对照显著增加。51.2 菌体特征特性中华人民共和国农业部 2 0 0 0-1 2-2 2 批准2 0 0 1 一 0 4-0 1 实施N Y 4 1 0-2 0 0 0 短杆状，无芽胞，革兰氏染色阴性。5.1.3 菌落形态特征 圆形、边缘整齐、稍突起，在含有刚果红的甘露醇一 酵母培养基平板上呈乳白色或无色半透明。5.2 产品技术指标5.2.1 液体根瘤菌肥料(见表 1)表 1 液体根瘤菌肥料技术指标项目指标备注外观、气味 乳白色或灰白色均匀混浊液体 或稍有沉淀。无酸臭气味根瘤菌活菌个数,1 0 8/m L)5.0杂菌率，%(5p H值6.0-7.2 用耐酸菌株生产的菌液，p H值可以大于 7.2寄主结瘤最低稀释度1 0-0 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测有效期，月3 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测5.2,2 固体根瘤菌肥料(见表 2)表 2 固体根瘤菌肥料技术指标项目指标备注外观、气味 粉末状、松散、湿润无霉块，无酸臭味，无霉味水分含量，%2 5-5 0根瘤菌活菌个数,1 0 1/g2.0杂菌率，肠(l op H值6.0 -7.2吸附剂颗粒细度 大粒种子(大豆、花生、豌豆等)用的菌肥，通过孔径。.1 8 m m标准筛的筛余物簇1 0%小粒种子(三叶草、首楷、紫云英)用的菌肥通过孔径0.1 5 m m标准筛的筛余物簇1 0%寄主结瘤最低稀释度1 0 s 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测有效期，月)6 此项仅在监督部门或仲裁检验双方认为有必要时才检测6 抽样 按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。6-飞 抽样工具及用品抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。6.2 抽样数量及抽样方法N Y 4 1 0-2 0 0 0 在成品库抽样，按“:.:”形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装(3 0 5 0 k g)产品以一袋(或一桶)为一件。抽样件数由样品基数的大小确定。1-1 0 件，全部抽样。1 1-2 0。件，抽样1 0 件;2 0 1-4 0 0 件，抽取2 0 件。样品基数大于4 0 0 件，按超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过 4 0 件。每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样 2 0 0 g。将所有样品混匀，按四分法缩到2 0 0 0 g，分装4 袋，然后封口。每2 袋为一份装人牛皮纸封样袋。最后贴上抽样标签和抽样封条(液体根瘤菌肥小包装产品抽样参照此法进行)。所抽样品一份留存被抽样单位，一份交检测中心检测。7 检验方法7 门仪器设备及试剂了.1-1 仪器设备 生物显微镜(l o x1 0 0);菌落计数器;恒温培养箱;恒温干燥箱;恒温摇床;灭菌锅;无菌室或超净工作台;酸度计;温室或植物光照培养箱:植物叶面光照强度大于8 0 0 0 I x,温度控制范围2 0-3 0 C;试管:0 1 5 m m X 1 5 0 m m冲1 8 m m X 1 8 0 m m;培养皿:直径9 c m;三角瓶:5 0 0 m L;无菌吸 管:1,2,5,1 0 M L;玻璃刮刀;滤纸;酒精灯;标准筛:孔径0.1 8 m m和0.1 5 m m;1 号羊毛画笔;无菌水;无离子水。7.1.2 试剂7.1.2.1 革兰氏染色试剂 结晶紫;番红;碘液;9 5%酒精。7.1.2.2 根瘤菌琼脂培养基 甘露醇(C,H 0 6)5 g 蔗糖(C,H,O)5 g 酵母粉。.5 9 磷酸氢二钾(K 2 H P 0,3 H 2 0)0.5 g 硫酸镁(Mg S O,7 H,O)0.2 gN Y 4 1 0-2 0 0 0 氯化钠(N a C l)O l g 硫酸钙(C a S O)0.1 g 铝酸钠(N a,Mo O,2 H,0)溶液1 ml 硫酸锰(MB S 0 4 4 H,O)溶液1 m L 柠檬酸铁(F e C J 1;0,)1 溶液1 m L 硼酸(H,B O,)1 Y o 溶液1 m l,刚果红(C I I H z 2 N 抓),S,N a,)l%溶液2.5 m L 琼脂1 8,-2 0 g 水1 0 0 0 m l,p H值7,07飞.23 马丁培养基(测霉菌数)磷酸二氢钾(K H 2 P o,7 H,O)0.5 g 葡萄糖(C,H,O,H,O)1 0.0 g 硫酸镁(Mg S 0 4.7 H,O)0.5 g 蛋白脏50 9 1%孟加拉红酒精(无水)溶液3.3 m L 琼脂1 8-2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 z n L 氯霉素。1 97.12.4 豆科植物结瘤试验琼脂斜面培养基 磷酸二氢钾(K H,P O,)0.2 2 rn g 氯化钾(K C I)1 5 5 m g 硫酸镁(M g s o,7 H,O)5 0 m g 硫酸锌 Z n S O,7 H,O)0.2 5 m g 硫酸铜(c u s o,.5 H 2 0)0.2 5 m g 硼酸(H,B O,)0.2 5 mg 铝酸钠(N a,M D O,，2 H,O)。.0 5 m g 柠檬酸铁(F e C,H,O,，x H,O)3 0 m g 硝酸钠(N a N O,)3 0 m g 琼脂5 1 0 g 水1 0 0 0 m l P H 7,0了.2 成品检验了21 气味检验 取根瘤菌肥料样品打开包装，进行感官检验。7.2.2 外观检验 将固体根瘤菌肥料包装打开，装在白色搪瓷盘中，将液体根瘤菌肥料摇匀。在明亮光线下进行感官检验7.2.3 p H值测定 液体根瘤菌肥料的p H值测定 取供检菌液直接测定p H值，取三次测定结果的平均数。固体根瘤菌肥料的p H值测定:取5 0 m L烧杯一个，加人菌肥2 5 g，无离子水2 5 m L a 通过磁力搅拌使溶液均匀后用酸度计测定g H值。取三次测定结果的平均数。了.2.4 含水量测定N Y 4 1 0-2 0 0 0 称取固体根瘤菌肥料三份，每份2 0.0 0 g,精确到0.0 1 g，放人已称恒重的铝盒中。置 J o s c干燥箱内烘烤 4 h,移至f 燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(1)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%0 含 水 量(%)二m 0-m X 1 0 0 。.，.，(1)阴 0式巾!/I。一 一烘干前样品质量，9;m 烘千后样品质量，9。7.25 吸附剂颗粒细度测定 称样 l o g(精确至0.0 1 g)，置于标准筛中(直径分别为0.1 8 m m和。1 5 m m)，用水冲洗，用毛笔轻刷。至粉末不再通过为止。将筛余物置1 0 5-1 1 0 C 温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式 2)计算:筛余物(%)=蜓 A量 二 t 1-兰 量宣 盛鱼亘 分塑样品质量x 1 Q O ，-(2)7.2.6 根瘤菌活菌数及杂菌率的测定 采用平板计数法测定根瘤菌活菌数及杂菌率。7.2 6.1 制作根瘤菌培养基平板(7.1.2.2)及马丁培养基平板(7.1.2.3)了2.6.2 样品稀释培养 称取1 0 g 供检样品(精确到。0 1 g),装人带玻璃珠及1 0 0 r n L无菌水的三角瓶中(供检样品为液体，则取1 0 m L加人内 装9 0 m L无菌水的三角瓶中)，置摇床振荡2 0 m in，转速2 0 0 r/m i n a 振荡好的样品静置2 0 m i n 后采用1 0 倍稀释法稀释至1 0-1(液体样品稀释至1 0-1)。从最后三个浓度悬液中各取0.1 m L，加至直径为9 c m的培养基平板上.用玻璃刮刀将菌液涂匀。每个稀释度重复三次。2 5-2 8 C 温度下培养3-7 d。用同样方法将1 0-,稀释度菌悬液。1 m L加到马丁培养基平板上。2 8 C 培养4 8 h,7.26.3 菌落鉴别及计数 根据被检产品标准描述的菌落特征，鉴别根瘤菌菌落与杂菌菌落。必要时进行革兰氏染色(方法见附录A).镜检，以区分根瘤菌菌落和其他菌落。取菌落3。一3 加 的平板计数。算出三个重复的根瘤菌及杂菌菌落平均数。杂菌是指样品所含有效活菌(包括根瘤菌及促生细菌)以外的其他种类微生物的总称杂菌总数是马丁培养基上出现的霉菌数与根瘤菌培养基上出现的杂菌数(霉菌除外)之和。根瘤菌数按式(3)计算，杂菌率按式(4)计算:.wn根瘤菌数C 亿个l g(m L)二菌落平均数 X稀释倍数 X基础液体积样品量 X 加样量杂菌率(%)=杂菌总数根瘤菌数+杂菌总数只 1 0 0.。，.一(4)7.2 7 稀释结瘤检验 寄主植物种子用0工%升汞溶液表面消毒后催芽，种芽长 1 一2 时用供试样品的 1 0-.1 0-稀释度的悬液接种，植于试管琼脂斜面上。设不接种的阴性对照和接种已知菌的阳性对照。重复6 次。植物培养温度2 0 2 5 C，植物叶面光照强度大于8 0 0 0 I x，每天光照1 2 h o 1 0 -2 0