NY 412-2000 磷细菌肥料.pdf

N Y 4 1 2-2 0 0 0前言本标准在原有标准N Y/T 2 2 7-1 9 9 4 微生物肥料 的基础上，对其中的磷细菌肥料部分进行修改主要修改内容如下:增加术语、抽样和判定规则部分;一 增加菌种部分，包括菌种有效性、菌体特性特征、菌落形态;删除成品无害化指标。因为磷细菌肥料一般以草炭为载体，不存在重金属的危害 草炭经高温灭菌后，大肠菌群和蛔虫卵不再存在 本标准自实施之 日起，同时代替N Y/T 2 2 7-1 9 9 4中的磷细菌肥料部分。本标准的附录A,附录B,附录C,附录D都是标准的附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准起草单位:农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所本标准主要起草人:梁绍芬、姜瑞波、葛诚、李俊、沈德龙中华人民共和国农业行业标准N Y 4 1 2 2 0 0 0磷细菌肥料P h o s p h a t e b a c t e r i a f e r t i l i z e r飞 范围本标准规定 了 磷细菌肥料产品的分类、技术要求、抽样、检验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存等本标准适用于含有益磷细菌微生物，能分解土壤中的难溶性磷化物，改善作物磷素营养状况，又能分泌刺激素刺激作物生长发育的活体微生物制品。2 引用标准下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性GB I T 6 6 4 3-1 9 8 6 瓦楞纸箱 N 丫4 1 1一 2 O O Q 固氮菌肥料3 定义 本标准采用下列定义3.1 磷细菌肥料 能把土壤中难溶性的磷转化为作物能利用的有效磷素营养，又能分泌激素刺激作物生长的活体微生物制品。4 产品分类4 ，按剂型不同分为:液体磷细菌肥料、固体粉状磷细菌肥料和颗粒状磷细菌肥料4.2 按菌种及肥料的作用特性分为:有机磷细菌肥料、无机磷细菌肥料。4.2.1 有机磷细菌肥料 能在土壤中分解有机态磷化物(卵磷脂、核酸和植素等)的有益微生物经发酵iG+f 成的微生物肥料。分解有机态磷化物的细菌有芽胞杆菌属中的种(B a c i l l u s s p.)、类芽胞杆菌属中的种(P a e ru b a c i l l u s s p.、4.2.2 无机磷细菌肥料:能把土壤中难溶性的不能被作物直接吸收利用的无机态磷化物溶解转化为作物可以吸收利用的有效态磷化物。分解无机态磷化物的细菌有假单胞菌属中的种(P s e u d o m o n a.v s p.),产碱菌属中的种(A l c a l i g e n e s s p.)硫杆菌属中的种(T h i o b a c i l l u s s p.使用本标准规定之外的菌种生产磷细菌肥料时 菌种必须经过鉴定，而且必须为非致病菌菌株5 技术要求5，飞 li d 种的有效性 用于生产磷细菌肥料的菌种，必须是从国家菌种中心或国家科研单位引进的并经过鉴定对动物和植物均无致病作用的非致病菌菌株;这些菌株在含有卵磷脂或磷酸三钙的琼脂平板 L 培养，能观察到明中华人民共和国农业部 2 0 0 0-1 2-2 2 批准2 0 0 1 一 0 4-0 1 实施N Y 4 1 2-2 0 0 0显的溶磷圈;发酵培养后解磷量与 不接菌对照比较有显著差异(p 0.0 5)05.1.1 有机磷细菌:芽胞杆菌属的细菌为革兰氏染色s0 it,能产生抗热的芽胞，为椭圆形或柱形周生或侧牛鞭毛，能运动，能产生接触酶。5 门.2 无机磷细菌:假单胞菌属中的细菌为革狡氏染色阴性杆菌，极生的单鞭毛或丛鞭毛.能运动.接触酶阳性。此属中的部分菌株为致病菌，必须进行严格的菌种鉴定后才能用于生产。产碱菌属的细菌.细胞呈杆状，1-4 根周生鞭毛，能运动，革兰氏染色呈阴性，接触酶阳性。硫杆菌属的菌为革兰氏染色阴性小杆菌，单根极生鞭毛，能运动.严格自养5.2 产品技术指标5.2.1 液体磷细菌肥料技术指标见表1 0 表 1 液体磷细菌肥料技术指标项日指标外观、气味浅黄或灰白色棍浊液体，稍有沉淀，微臭或无臭味有效活菌数亿个/.I-有机磷细菌肥料李 2.0无机磷细菌肥料 1.5杂菌率1)，%1.5无机磷细菌肥料李1.0细度(粒径)通过孔径。.2 0.-标准筛的筛余物(1 0%p H值杂菌率,%6.0-7.5簇1 0有效期，月65.2.3 固体(颗粒)磷细菌肥料技术指标见表3 0表 3 固体(颗粒)磷细菌肥料技术指标项目指标外观、气味水分，%松散、黑色或灰色颗粒，微臭蕊1 0有效活菌数 亿个/g有机磷细菌肥料 0.5无机磷细菌肥料0.5N Y 4 1 2-2 0 0 0表 3(完)项目指标p H值G.0 7.5一摊率，%一.。一 一 一有 效 期 月I -66 抽样 按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染6 门抽样工具及用品 抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水62 抽样数量及抽样方法 在成品库抽样，可按“:.:，形分层设点抽取，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件 大包装(3 0 5 0 k g)产品以一袋(或一桶)为一件 抽样件数由样品基数的大小确定。1 0 件以内全部抽样:1 1 2 0。件抽样1 0 件;2 0 1 -4 0 0 件抽取2 0 件。样品基数大于4 0 0 件者，按超过部分的2%增加抽样件数卜 但总件数不要超过4 0 件。每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样2 0 0 g。然后将所有样品棍匀，按四分法缩到2 0 0 0 g，分装4 袋，然后封口。每2 袋为一份装人牛皮封样袋 最后贴上抽样标签和抽样封条(液体肥料小包装亦参照此法进行)。所抽样品一份留存被抽样单位，一份交检测中心检测。7 检验方法7.1 仪器设备及试剂7.1.1 仪器设备 恒温培养箱;恒温千燥箱;恒温摇床;高速离心机;生物显微镜(l o x 1 0 o);高压灭菌锅;酸度计;扭力天平(分度值0,0 1 g);菌落计数器;无菌室或超净工作台;培养皿:直径 9 c m;三角瓶:5 0 0 mL,1 0 0 m l;烧杯:5 0 0 ml;量筒:1 0 0 ml;无菌吸管:0.5,1.0,5.0,1 0.0 m L;玻璃刮刀;滤纸;酒精灯;标准筛:孔径().1 8 mm,2.5 m m,5.0 m mN Y 4 1 2-2 0 0 0 铝 盒;t号羊毛画笔7 门.2 试剂和培养基7.1.2 门试A 9 蒸馏水;尤离子水;无菌水了 1.22 培养基(见附录n)7 门.2.2 门肉汤培养基(见附录 D l)7.1.2.2.2 有机磷细菌培养基(见附录D 2)e7.1.2.2.3 无机磷细菌培养基(见附录D D.7 门.2-2.4 马丁培养基(见附录D 4)o了.2 成品检验了2 门气味检验 将液体或固体磷细菌肥料的包装打开，用手煽动包装口处的空气，嗅其气味。了.2.2 外观检查 将固体磷细菌肥料包装打开，置于白色搪瓷盘中，液体肥料摇匀，在明亮的光线下进行观察。7.2.3 u H值测定 液体磷细菌肥p H值的测定:取供检菌液于5 0 m 工 _ 烧杯中直接用酸度计测定p H值，取三次测定结果的平均值 固体磷细菌肥p H值的测定:在分度值。.0 1 g 的扭力天平上称取供检样品1 5.0 0 g,置于5 0 0 m l,烧杯中，用量筒量取 3 0.0 ml蒸馏水，用磁力搅拌或手摇动 1 mi n，然后静止 3 0 mi n，用酸度计测其p H值，重复3 次，取其算术平均值。了2.4 含水量测定 称取固体磷细菌肥料3 份，每份2 0.0 0 g，精确到0.0 1 g，放入已称恒重的铝盒中，置1 0 5 C 干燥箱内烘烤4 h，移至干燥器内，冷却后称重。取三个样品测定数的平均值平行样品绝对偏差应低于 1%0 含水量按式(1)计算 含 水 量%，一 塑 盖 考X 1 0 0 一)式中:。-一烘干前样品质量，9;r n,-一 烘干后样品质量，97.2.5 吸附剂颗粒细度测定 准确称取1 0.0 g 样品，置于孔径。.2 0 m m的标准筛中，用水冲洗，用毛笔轻刷至样品不再通过为止将筛余物置1 0 5-1 1 0 C 温度下烘干，称重 筛余物百分含量按式(2)计算:筛余物(%)一筛余物重 一(1一样品含水量百分数)样品质量火 1 0 0 一(2)颗粒肥料的粒径称样后直接过 2.5 m m和 4.5 m m的标准筛即可。7.2.6 磷细菌肥料有效活菌数及杂菌率的测定 采用平板计数法测定有效活菌数和杂菌率。7.2.6 门制作肉汤培养基平板和马丁培养基平板(配方见附录n)了2.6.2 样品稀释培养及计数 称取l O g 供检样品(精确到。.O 1 g),装人带玻璃珠及1 0 0 m l 无菌水的三角瓶中(如供检样品为液N Y 4 1 2-2 0 0 0体，则取 1 0 m1 _ 加人装 9 0 mL无菌水的分角瓶中)，置转速为 2 0 0 r/m i n的摇床振荡 3 0 mi n，然后静置2 0 m i n后用1 0 倍稀释法稀释至1 0(液体样品稀释至1 0 )从最后三个浓度悬液中各取。.1 m L加到直径9 c m含培养基的平板上，用玻璃刮刀将菌液涂匀。每个稀释度重复3 次。2 8-3 0 C 温度下培养 2-5 d。在马丁培养基上加人 1 0-稀释度悬液测定霉菌数.7.2.6.3 菌落鉴别及计数 根据被检产品菌种的菌落特征与杂菌区别开 必要时进行革兰氏染色(见附录A)或芽胞染色(见附录B)，在显微镜下观察，取菌落2 0 3 0 0 的平板计数。计算出三个重复的有效磷细菌菌落平均数。有效磷细菌菌落以外的其他细菌菌落为细菌杂菌菌落数在马丁培养基上计出霉菌菌落数。有效磷细菌活菌数按式(3)计算:有效磷细菌活菌数(个/9)=有效菌落平均数 X母液体积(ml)称样量娘)X 加样量(ML)X 稀释倍数.(3杂菌数为马丁培养基上的霉菌数与选择培养基上出现的杂菌数之和。杂菌数按式(4)计算.(4)杂菌数(个/9)=杂菌菌落平均数 X稀释倍数 X杂菌率按式(5)计算:母液体积(ML)样品量(g)X加样量(m L)杂菌率(%)=7.2.6.4 磷细菌解磷效能测定7.2-6.4 门平皿定性测定杂菌菌落平均数磷细菌菌落平均数+杂菌菌落平均数又 1 0 0 。(5)将有机磷细菌或无机磷细菌培养基融化后冷却至4 5 C 左右倒人灭菌平皿，每皿约1 5 m L左右，凝固后培养基表面无冷凝水后待用。待测菌种活化后加人适量无菌水，刮下菌苔，制成均匀的菌悬液。用灭菌滴管滴人备用的平板上，每皿可均匀地分别滴四个点。待滴人的菌悬液干后才可反转置于 2 8-3 0 C 恒温箱中培养，2-3 d 后可观察结果。在菌落周围有透明圈为有溶磷或解磷作用，无透明圈的为不溶磷、少溶磷，或不解磷、少解磷7.2-6-4.2 钥锑抗比色法定量测定 将磷细菌接种到相应的磷细菌液体培养基的三角瓶中，置摇床(2 0 0 r/m i n)上保温3 0-C 振荡培养7 2 h下摇床后加人无磷活性炭脱色高速离心，将上清液倾出待测 用铝锑抗比色法测定有效磷含量(见附录 B)了.2.了 有效期的检验 在产品说明书标明的有效期到达前1 0 d 测定活菌数，活菌数达到标准要求的即为有效期合格。8 检验规则(判定规则)8 门检验分类8.1.1 产品出厂检验 产品交货时进行的检验。8.1.2 产品型式检验 新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。8.2 检验项目 型式检验的检验项目按 s.2.1 或 5.2.2 要求进行。出厂检验不检有效期。8.3 判定规则 菌肥中有效菌活菌的数量是微生物肥料质量关键指标，是一切微生物肥料的产品必须达到的指标。所规定的外观、水分、细度、有机质、p H值作为微生物肥料质量检验参考指标。对产品是否合格作如下规定:N Y 4 1 2一 2 0 0 0 。)有效活菌数不合格时该产品判定为不合格产品;b)有效活菌数合格，杂菌率合格，