DB21T 3717-2023 李、杏品种鉴定SSR分子标记法.pdf

ICS65.020.20CCS B 0521辽宁省地方标准DB21/T 37172023李、杏品种鉴定 SSR 分子标记法2023-04-30 发布2023-05-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37172023I前言本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。本文件起草单位：辽宁省果树科学研究所。本文件主要起草人：刘硕、刘宁、刘威生、章秋平、张玉萍、马小雪、张玉君、徐铭、赵海娟、刘家成。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024-23447862。文件起草单位通讯地址：辽宁省果树科学研究所（辽宁省营口市鲅鱼圈区熊岳镇铁东街），联系电话：0417-7033462。DB21/T 371720231李、杏品种鉴定 SSR 分子标记法1范围本文件规定了利用简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）分子标记法进行李（Plum）、杏（Apricot）品种鉴定的主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、参照种质、操作步骤、基因型对比、结果判定等要求。本文件适用于利用SSR分子标记指纹对比快速鉴定李、杏种质资源。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 19557.1植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则GB/T 19557.30植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 梨GB/T 30988多酚类植物基因组 DNA 提取纯化及测试方法GB/T 30989-2014高通量基因测序技术规程GB/T 37870个体鉴定的高通量测序方法NY/T 2594植物品种鉴定 DNA 分子标记法 总则3术语和定义NY/T 2594界定的术语和定义适用于本文件。4缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对（Base pair）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（Cetyltrimethylammonium ammonium bromide）dd H2O：重蒸馏水（Distilled and deionized water）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）Hi-Di：去离子甲酰胺（Highly deionized formamide）nt：碱基（Nucleotide）PCR：多聚酶链式反应（Polymerase chain reaction）PVP：聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone）TE：Tris-EDTA 缓冲液（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0）5原理DB21/T 371720232李、杏的不同种质资源，其基因组存在着能够进行稳定遗传的简单重复序列SSR的重复次数差异。这种差异可以通过从抽取具有代表性的检测样品种提取DNA，利用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其扩增产物片段大小加以区分。6主要仪器设备与试剂耗材高速离心机、分光光度计等主要仪器设备，氯仿、异戊醇等试剂，移液枪配套枪头、枪头盒等耗材，具体见附录A。7试剂配制试剂配制方法见附录B。8SSR 引物用于李、杏品种鉴定的优异SSR引物有45对，见附录C。退火温度55-57。9参照品种参照品种见附录D。10操作步骤10.1样品准备受检及参照李、杏品种样品均采集幼嫩叶片，按照 GB/T 30988-2014，8 提取步骤改良。每份待测品种和参照品种选取 3 个单株进行混合分析。于春季分别自每个样株上采集新鲜、幼嫩、健康的叶片两片（约 1g）混合置于离心管，做好标记置于液氮中浸泡后，保存于-80冰箱。10.2DNA 提取采用改良CTAB法提取李、杏样品DNA；或利用植物基因组DNA提取试剂盒依照说明书进行提取。在通风环境或通风橱进行提取。改良CTAB法DNA提取步骤如下：a)将液氮冷冻后的叶片样品放入研钵中磨成粉末，然后迅速将0.2g左右粉末转入2mL离心管中，加入65预热的CTAB提取液600L，（加入适量PVP粉末或1%的-巯基乙醇溶液），充分混匀1min后置于65水浴锅中50min，每隔5min摇荡1次；b)取出离心管置于冰上10min，然后置于4高速离心机中，12000rpm离心15min。使用移液枪取上清液至新1.5mL离心管中；c)加入20g/L RNA消化酶10L并摇晃均匀，随后置于37培养箱消化60min；d)取出离心管加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）后，充分混匀，室温下静置10min，离心机12000rpm离心15min；DB21/T 371720233e)取上清液500L置于新的1.5mL离心管中。加入1.0mL的-20冰乙醇溶液，轻轻摇晃，置于-20冰箱60min或4过夜；f)取出离心管并置于4高速离心机中，12000rpm离心30min，弃上清，利用75%乙醇洗涤沉淀两次，管口向下置于室温下自然晾干；g)加入100L TE溶液溶解DNA沉淀，待完全溶解后利用核酸测定仪检测DNA浓度和纯度，将DNA浓度稀释至20ng/L，置于-20冰箱保存。注：其他所获DNA质量能够满足后续PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本文件。10.3PCR 扩增10.3.1PCR 反应体系总体积20L。包括DNA模板5L（20ngL），上游荧光引物1L（10nM），下游普通引物1L（10M），2 Taq DNA聚合酶Mix 10L，ddH2O 3L。10.3.2PCR 反应程序PCR反应程序如下：a)95变性5min；b)95变性30s；c)依照附录C推荐的引物退火温度退火30s；d)72延伸45s；e)重复b-d步骤35个循环；f)72延伸10min；g)PCR产物置于4保存。10.4PCR 扩增产物检测10.4.1PCR 产物纯化将PCR扩增产物置于96孔PCR板进行纯化操作，步骤如下：a)20LPCR产物加入5L 5M的NaCl（终浓度0.5M）；b)加入25L 24的PEG8000溶液（终浓度12），混匀；c)置于室温30min；d)置于离心机4500 xg，4离心30min后，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150 xg，去除上清；e)加入70L 75乙醇，4500g，4离心15min，立即将板反扣在厚的吸水纸上，离心至150g，去除上清，重复一次；f)50或室温干燥，加入10L ddH2O溶解，即为纯化的PCR产物。10.4.2毛细管电泳上机样品制备DB21/T 371720234毛细管电泳上机样品制备，步骤如下：a)每份纯化后的PCR产物取1L于新的96孔PCR板中，每份样品加入0.5L内标（GS500LIZ）及50L的Hi-Di稀释液，剧烈震荡5min，使内标充分混匀；b)将96孔平板放入PCR仪中，95加热5min，程序结束后迅速放在冰上冷却2min。做好上机表后，在ABI3730 DNA测序仪进行检测。11基因型对比每个样品SSR位点的等位变异以扩增产物峰值大小的形式表示。使用Genemapper4.0软件读取ABI3730检测的等位基因峰图（图1，图2，图3），依照软件说明书整理每对引物在每份品种中扩增产物峰值的保留时间并记录在EXCEL表格中，汇成基因型矩阵。根据待测品种与参照品种的SSR等位基因长度、位点和与杂合特性，确定是否有差异。图1 三种杏品种4种荧光SSR引物检测峰图DB21/T 371720235图 2 SSR 引物ampa101（编号 4）等位基因峰图图 3 SSR 引物 ssrpacita5（编号 110）等位基因峰图12结果判定12.1 判定方法当品种间差异位点数2 时，判定为不同品种；当品种间差异位点数2 时，判定为疑同品种。注：必要时，可按照GB/T 19557.1 和 GB/T 19557.30 给出的原则进行田间测试，确定品种间在形态上是否存在明显差异。12.2 结果表述待测样品_与对照样品_（或数据库中_已知品种）利用_分子标记类型，采用_检测平台，采用_位点组合进行检测，结果显示：检测位点数为_，差异位点数为_，判定为_（相同或疑同）。DB21/T 371720237附录A（规范性）主要仪器设备与试剂、耗材主要仪器设备与试剂、耗材见表 A.1。表 A.1 主要仪器设备与试剂、耗材步骤/类别主要仪器设备主要试剂主要耗材DNA 提取高速离心机、分光光度计、移液器、水浴锅、天平、磁力搅拌器十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氯化钠、三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱）、-巯基乙醇溶液、RNA 消化酶、氯仿、异戊醇、冰乙酸、冰乙醇、液氮1.5mL、2mL 离心管、移液枪配套枪头、枪头盒、研钵、乳胶手套PCR 扩增PCR 扩增仪器、制冰机TaqMix 酶(Taq DNA 聚合酶 Mix)、SSR荧光引物、ddH2O96 孔 PCR 板毛细管凝胶电泳ABI3730 DNA 分析仪Hi-Di 高纯甲酰胺、内标（GS500LIZ）96 孔 PCR 板、移液枪配套枪头、枪头盒DB21/T 371720238附录B（规范性）试剂配制方法B.1DNA 提取试剂的配置B.1.11.0M Tris-HCL 溶液（pH=8.0）称量 121.1 g Tris 置于 1 L 烧杯中，加入约 800 ml 的 dd H2O，充分搅拌溶解，用浓盐酸调节 pH值至 8.0（约加入 42mL 的浓盐酸）。将溶液定容至 1L，高温高压灭菌后，室温保存。B.1.20.5M EDTA 溶液（pH=8.0）称取 186.1gNa2EDTA2H2O，置于 1 L 烧杯中；加入约 800 mL 的 dd H2O，充分搅拌；用 NaOH 调节 pH值至 8.0（约 20g NaOH)；加 dd H2O 将溶液定容至 1 L；高温高压灭菌，室温保存。B.1.32%CTAB 溶液分别称取 CTAB 20g，NaCl 81.816g，PVP20g，分别量取 1M Tris-HCl 溶液（pH=8.0）100 mL，0.5MEDTA 溶液（pH=8.0）40mL，定容至 1000 mL。B.1.4氯仿异戊醇（24:1）分别量取 240mL 氯仿和 10mL 异戊醇，将两者混匀。B.1.575%乙醇溶液量取 150mL 无水乙醇，50mL ddH2O 置于烧杯中，充分混匀。DB21/T 371720239附录C（规范性）SSR 引物SSR 引物见表 C.1。表 C.1SSR 引物原始编号引物名称染色体正向引物序列（5-3）反向引物序列（3-5）1ampa1013cagtttgatttgtgtgcctctcgatccaccctttgcataaaatc2ampa1125caaagtgtcattgttcttgctagaaggccaaaactccagtagaag3cpdct040-tgatgaggcctagaaattggacacagcaatcagcaaaaagc4cppct0135gcatttcgagagctgtatttgtcttacgtgcagcttcatt5cpsct0054ctgcaagcactgcggatctccccatattcccaacccatta6cpsct0342aggtggacaatagccgtgattttccagaccctgagaaagc7pchgms54cgcccatgacaaacttagtcaagaggtacaccag8udap-4132ccaggacccaaaccctaaaatgcaaacacaacacctacctaca9udap-4184cagaaatagccccagcacatttcttgcgccaaaaacaact10