DB53T 447.4-2012 BMY牛 第4部分：胚胎移植技术规范.pdf

ICS 65.020.30 B 43 中华人民共和国国家质量监督 检验检疫总局备案号：35941-2013 DB53/T 447.42012 BMY 牛 第 4 部分：胚胎移植技术规范 2012-12-01 发布 2013-03-01 实施云南省质量技术监督局 发 布 DB53/T 447.42012 I 前 言 DB53/T 447BMY牛分为以下部分：第 1 部分：品种；第 2 部分：标准化规模养殖场建设规范；第 3 部分：人工授精技术规范；第 4 部分：胚胎移植技术规范；第 5 部分：体外胚胎生产技术规范；第 6 部分：饲养管理规范；第 7 部分：饲草加工调制技术规范；第 8 部分：育肥技术规范；第 9 部分：疾病防治技术规范；第 10 部分：档案管理；第 11 部分：胴体生产、评定及分割技术规范。本部分为DB53/T 447的第4部分。本部分按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写给出的规则起草。本部分由云南省农业厅提出。本部分由云南省质量技术监督局归口。本部分起草单位：云南省草地动物科学研究院。本部分主要起草人：和占星、王喆、张继才、王安奎、刘建勇、金显栋、赵刚、黄必志、袁希平。DB53/T 447.42012 1 BMY 牛 第 4 部分：胚胎移植技术规范 1 范围 DB53/T 447的本部分规定了胚胎移植的基本原则、供受体牛同期发情处理、供体牛的超数排卵与输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛的妊娠诊断等技术要求。本部分适用于BMY牛的超数排卵及胚胎移植（MOET）的各个环节。2 规范性引用文件 下列文件对于本规范的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4143 牛冷冻精液 DB53/T 447.3 BMY牛 第3部分：人工授精技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 供体牛 提供卵子和胚胎的优秀繁殖母牛。3.2 受体牛 接受胚胎（移植）的母牛。3.3 同期发情 使用外源激素来调控一群母牛的发情进程，使之在预定的时间内集中发情和排卵。3.4 超数排卵（简称超排）在母牛发情周期的适当时间，使用外源性腺激素，诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。3.5 胚胎冷冻 按胚胎冷冻的原理和方法，使胚胎在液氮中保存。3.6 胚胎移植 将受精卵（胚胎）移植到受体母牛子宫角内。4 胚胎移植的基本原则 DB53/T 447.42012 2 4.1 供体和受体母牛应为同一属种；4.2 供、受体发情时间相差不应超过 24 h；4.3 从供体输卵管内收集到的胚胎应移植到受体的输卵管内，从供体子宫角内收集到的胚胎应移植到受体的子宫角内。5 供体牛的选择与饲养管理 5.1 供体牛的选择 供体牛应符合下列要求：a)符合 BMY 牛的典型特征，系谱清楚，遗传性稳定，种用价值高；b)健康、体质健壮、膘情中等；c)性周期正常，生殖机能好；d)年龄 14 月龄到 10 岁,体重 280 kg600 kg；e)经产母牛产后 60 天以上，生殖机能恢复正常。5.2 供体牛的饲养管理 5.2.1 保持环境卫生，避免各种应激。5.2.2 分群饲养，专人管理。5.2.3 适当调整日粮标准，注重补充青绿饲料、维生素和微量元素，保持营养平衡，使其在超排处理前达到较理想的生理状态。6 供体牛的超排及输精 6.1 超排处理 6.1.1 超排激素 FSH（促卵泡素）、PG（前列腺素及其类似物）、CIDR或CUE-MATETM（孕酮阴道栓）、GnRH（促性腺激素释放激素）、LH（促黄体生成素）等。6.1.2 超排方法 6.1.2.1 FSH+PG 法 在发情周期的任一天对母牛用一次 PG 法进行同期发情处理或选择自然发情的供体牛在发情周期的第 10 天11 天开始采用递减法每天早晚各注射一次 FSH，连续注射 4 天，在注射 FSH 的第 3 天注射PG 诱导发情。6.1.2.2 CIDR或 CUE-MATETM+FSH+PG 法 以供体牛发情当日为 0 天，在第（61）天置入 CIDR或 CUE-MATETM，第 1011 天开始注射 FSH，连续注射 4 天，第 12 天13 天(FSH 注射第 3 天)注射 PG，同时取出 CIDR 或 CUE-MATE。6.1.2.3 超排激素组合及用量 可采用下列任意一种激素组合进行超排：a)日本产 FSH 2436 A.U.+美国产 PG 30 mg35 mg 或国产氯前列烯醇 0.6 mg0.8 mg；DB53/T 447.42012 3 b)加拿大产 FSH 320 mg380 mg+PG 30 mg35 mg 或国产氯前列烯醇 0.6 mg0.8 mg；c)国产 FSH 10 mg12 mg+国产氯前列烯醇 0.6 mg0.8 mg。6.2 发情鉴定 在注射 PG 24 h 后进行发情鉴定，发情鉴定方法按 DB53/T 447.3 的规定执行。6.3 冷冻精液质量检查 应符合GB 4143的规定。6.4 输精 采用直肠把握输精法适时输精。输精方法按DB53/T 447.3的规定执行。在第一次输精时注射GnRH或其类似物50 g100 g或在第一次输精时注射LH 2000 IU3000 IU。7 胚胎回收（冲胚）7.1 冲胚时间 供体牛以超排发情后第一次输精当日为 0 天，在第（7 0.5）天，用非手术法回收胚胎。7.2 冲胚前的准备 7.2.1 冲胚所需主要器材 冲胚管及内芯、子宫颈扩张棒、子宫颈黏液吸除器、过滤式集卵（胚）杯、Y字型三通硅胶管、50 mL注射器、20 mL注射器、10 mL注射器、5mL注射器、培养皿、量筒、毛剪、镊子等。7.2.2 冲胚所需要药品 新洁尔灭、2%利多卡因、0.9%生理盐水、酒精、青霉素、链霉素等。7.2.3 冲胚液的配制 基液：杜氏磷酸缓冲液（PBS），配方见附录A。也可用进口PBS粉配制。冲胚液：含1%FCS（胎犊血清）或CS（犊牛血清）加抗生素的PBS液。7.2.4 冲胚步骤 7.2.4.1 供体牛的保定与麻醉：将供体牛在保定架内站立保定好，用 2%利多卡因或普鲁卡因 3 mL5 mL进行硬膜外腔麻醉。7.2.4.2 供体牛外阴的清洗与消毒：将牛尾固定，清除直肠中的粪便。母牛阴部先用清水清洗，再用新洁尔灭溶液清洗，然后用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉消毒。7.2.4.3 扩张子宫颈与去除黏液：用子宫颈扩张棒扩张子宫颈口，再用黏液吸除器清除子宫颈黏液。7.2.4.4 冲胚管的准备与插入：检查冲胚管气囊是否完好，用冲胚液湿润内芯并插入冲胚管固定；将冲胚管缓慢插入到子宫角前端；用吸满 20 mL 空气的注射器向气囊内注入空气（冲气量：青年牛 10 mL15 mL，经产牛 15 mL18 mL），并确定其是否在子宫角内的位置，固定冲胚管；抽出内芯，连接冲胚管与 Y 字型三通管。7.2.4.5 冲胚：关闭三通管输出管开关，用 50 mL 注射器或自动灌流仪每次吸取 20 mL50 mL 冲胚液从输入管注入子宫角，关闭输入管开关，用直肠中的手将子宫角上扬并进行适度按摩，打开输出管开关，DB53/T 447.42012 4 使回收液从输出管流到集卵杯中，每侧子宫角冲洗 610 次，每侧子宫角用 250 mL300 mL 冲胚液。冲胚液注入原则是根据供体牛子宫角的大小，先少后多，逐渐增量。一侧子宫冲胚完毕后，用注射器筒接到冲胚管的注气口将气囊中的气体放出，抽出冲胚管。用同样的方法对另一侧子宫角冲胚。两侧子宫角冲胚完成后，冲胚抽回至子宫体，灌注抗菌素（青霉素 200 万单位链霉素 100 万单位溶液 20 mL50 mL）或其它预防子宫炎的药物。同时，肌肉注射 PG（氯前列烯醇 0.4 mg0.6 mg）。7.2.4.6 将回收液送回实验室或检胚室，用集卵漏斗过滤，保留 10 mL 左右的液体，倒入培养皿中，供镜检。8 胚胎质量鉴定 8.1 检胚 在实验室（检胚室）内 20 25 常温下，将盛有回收液的培养皿或集卵杯置于实体显微镜下检胚，按图 1 所示顺序检胚，重复 34 遍。检出的胚胎及时移放到盛有含 20犊牛血清（CS）的 PBS保存液或 TCM-199 培养液的小培养皿中（同一供体胚胎放入同一培养皿中），并做好标记。用 PBS 将胚胎清洗 35 次，然后进行胚胎质量鉴定。图 1 检胚顺序 8.2 胚胎的质量鉴定 8.2.1 形态学方法 8.2.1.1 基本原理 在4080倍的实体显微镜或倒置显微镜下观察受精卵受精与否、发育状态、形态轮廓、色泽、卵裂球的大小、均匀度、细胞密度、透明带间隔、变性程度以及胚胎本身的发育阶段是否与胚胎实际日龄相一致等。8.2.1.2 胚胎发育阶段鉴定 8.2.1.2.1 供体超排发情后第（70.5）天的胚胎发育期划分为以下六个：f)桑椹胚（Morula，M）：卵裂球隐约可见，内细胞团基本占满卵周间隙；g)致密桑椹胚（Compact Morula，CM）：卵裂球进一步分裂变小，看不清卵裂球的界线，内细胞团致密收缩，占卵周间隙的 60%70%；DB53/T 447.42012 5 h)早期囊胚（Earely Blastocyst，EB）：出现透亮的囊胚腔，开始分为发暗的内细胞团和明亮的滋养层，但两层界线尚不明晰，细胞团占卵周间隙的 70%80%；i)囊胚（Blastocyst，BL）：囊胚腔增大明显，内细胞团和滋养层细胞界线清晰，细胞充满卵周间隙；j)扩张囊胚（Expanded Blastocyst，Exp）：囊胚腔充分扩张，体积增至原来的 1.21.5 倍，透明带变薄，约为原厚度的 1/3；k)孵化囊胚（Hatched Blastocyst，Hed 或 HB）：囊胚腔扩张到一定程度，透明带裂，胚胎细胞团脱出透明带。8.2.1.2.2 供体牛排卵后不同时间的胚胎发育阶段见表 1。表1 母牛排卵（受精）后不同时间的胚胎发育阶段 时间 天 01 12 23 34 45 56 67 78 810胚胎形态 发育阶段 1 细胞 2 细胞4 细胞 8 细胞16 细胞早期桑葚胚 致密桑葚胚 早期囊胚 囊胚 扩张囊胚 孵化囊胚8.2.1.3 胚胎质量等级 8.2.1.3.1 胚胎质量划分为下列四个等级：l)1 级：即优质胚，胚胎发育阶段正常、形态完整、轮廓清晰、色泽正常、几乎无水泡样卵裂球，没有变性细胞；m)2 级：即良质胚，发育阶段正常、形态基本正常、完整、轮廓清楚，但有一部分突出细胞可见，变性部分占在 10%以下；n)3 级：即一般胚，发育阶段正常、突出的细胞或不均匀较明显，变性部分占 10%30%；o)4 级：即不良胚，发育阶段迟缓、细胞不均匀、变性细胞明显，变性部分占 30%50%；发育缓慢和未受精卵。8.2.1.3.2 1 级3 级为正常胚胎，其中 12 级胚胎可供鲜胚移植和冻胚保存；3 级胚胎需经培养，从形态判断存活力后决定是否移植或冷冻或舍弃；4 级胚不能使用。8.2.2 体外培养法 将被鉴定的胚胎用 TCM-199FCS 或 TCM-199FCS-ME（-巯基乙醇）培养液，在 5%CO2、95%空气、38.5、饱和湿度的培养箱中培养 24 h48 h，判断胚胎是否存活和活力。桑椹胚、早期囊胚以培养后的扩张囊胚率和孵化胚率来衡量胚胎的质量，扩张囊胚率和孵化率高表明胚胎质量好，形态正常的胚胎经培养后的孵化率应在 70%以上。9 胚胎的冷冻保存及解冻 9.1 胚胎的冷冻保存 9.1.1 胚胎冷冻保存所需要仪器、器材 实体显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、细管、胚胎吸管、0.22 m过滤器、培养皿、记号笔等。DB53/T 447.42012 6 9.1.2 保存液与冷冻液 9.1.2.1 保存液：含有 20%犊牛血清(CS)的 PBS 液。9.1.2.2 冷冻液：8%乙二醇（EG）0.1 mol/L 海藻糖（Tre.）m-PBS20%CS,用 0.22 m 滤器过滤灭菌分装。9.1.3 胚胎