DB15T 2542-2022 鸡腿菇菌种制作技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B05 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 25422022 鸡腿菇菌种制作技术规程 Regulation of strain manufacture for coprinus comatus 2022-04-25 发布 2022-05-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 25422022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区果蔬标准化技术委员会（SAM/TC 25）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：李亚娇、孙国琴、王海燕、庞杰、慕宗杰、王永、薛国萍、康立茹、于传宗、付崇毅、田文龙、郭志英。DB15/T 25422022 1 鸡腿菇菌种制作技术规程 1 范围 本文件规定了鸡腿菇各级菌种生产技术要求。本文件适用于鸡腿菇母种、原种和栽培种菌种生产技术。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4806.7 食品安全国家标准 食品接触用塑料材料及制品 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。鸡腿菇 coprinus comatus 隶属真菌门担子菌亚门、伞菌纲、伞菌目、伞菌科，菌盖初期呈圆柱状，逐渐脱离菌柄，呈钟状，颜色洁白，表面有反卷鱗片。菌肉白色，菌褶早期为白色，与菌柄离生逐渐变为褐色，老熟后呈黑色并潮解成墨汁状。菌柄圆柱状，白色，菌环白色，生于菌柄中上部，易脱落。因外形酷似鸡腿，肉质似鸡丝而得名。菌种 spawn 通过生产试验验证具有特异性、均一性和稳定性，丰产性好、抗性强的菌株或品种，生长在适宜基质上具结实性的菌丝培养物，包括母种、原种和栽培种。母种 stock culture 经各种方法选育得到的具有结实性的菌丝体纯培养物及其继代培养物。也称为一级种、试管种。原种 pre-culture spawn 由母种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物，也称为二级种。DB15/T 25422022 2 栽培种 spawn 由原种移植、扩大培养而成的菌丝体纯培养物。栽培种只能用于扩大到栽培出菇袋或直接出菇，不可以再次扩大繁殖菌种，也称为三级种。固体菌种 solid spawn 以富含木质素、纤维素和半纤维的谷物籽粒等天然有机物为主要原料，添加适量的有机氮源和无机盐类，具一定水分含量的培养基培养的纯菌丝体。液体菌种 liquid spawn 在液体培养基中，通过摇瓶震荡培养或深层发酵技术快速获得的大量的纯双核菌丝体。4 菌种生产要求 人员 生产所需要的技术人员和检验人员经过专业培训、掌握基础知识及菌种生产技术规程要求的相应专业技术人员。环境 选择地势高，通风良好，空气清新，水源近，排水通畅，交通便利的场所。300 m之内无酿造厂、集贸市场、规模养殖的畜禽舍、垃圾和粪便堆积场，无污水、废气、废渣、烟尘和粉尘等污染源，环境条件符合NY/T 528规定。设施 菌种生产需要粉碎机、电子秤、搅拌机、装袋机、高压灭菌锅或常压灭菌锅、离子净化器、超净工作台或接种箱、恒温培养箱、培养架、恒温摇床、液体菌种灌（30 L600 L）、显微镜等设备。厂房 厂房要求有各自隔离的摊晒场、原材料库、配料分装库。配套有配料室、搅拌室、装袋室、灭菌室、冷却室、接种室、培养室（通风好，有纱窗）、菌种检测室及菌种冷藏库等各环节的设施。容器 4.5.1 母种生产容器 试管规格18 mm180 mm 或者20 mm200 mm；培养皿直径7 cm9 cm培养皿；三角瓶规格300 ml500 ml。4.5.2 原种、栽培种生产容器 原种采用850 ml以下、瓶口直径小于等于4 cm、耐126 高温的透明瓶子，或采用（1217）cmDB15/T 25422022 3（2228）cm的聚丙烯塑料袋。聚丙烯塑料袋符合GB 4806.7要求。栽培袋采用（1722）cm（3555）cm的聚乙烯塑料袋。5 母种生产 培养基 新鲜无病去皮切片马铃薯 200 g，加水 1200 ml 煮沸 20 min，滤液定容至 1000 ml，加硫酸镁 0.5 g、磷酸氢二钾 1 g、蛋白胨 1 g、酵母粉 1 g、蔗糖 10 g、葡萄糖 10 g、琼脂粉 8 g10 g，pH 自然；新鲜无病去皮切片马铃薯200 g，加水1200 ml 煮沸20 min，滤液定容至1000 ml，加入蔗糖20 g、琼脂粉8 g10 g，pH自然。分装和灭菌 5.2.1 斜面培平板培养基分装和灭菌 分装培养基至试管1/4处，用棉塞或硅胶塞封闭试管口，每5支试管为1把，牛皮纸包棉塞，橡皮筋扎紧，棉塞向上放置。棉塞应采用梳棉，不能使用脱脂棉。121 122（0.11 MPa0.12 MPa）恒温灭菌25 min。降温至（655）时取出试管，在空气清洁的室内摆斜面，斜面长度不超过试管长度的2/3，自然降温凝固后成斜面。5.2.2 平板培养基分装和灭菌 培养基装入300 ml500 ml 三角瓶至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后放入灭菌锅；玻璃培养皿用报纸包好，放入灭菌锅。在温度升至102 105 排净冷空气后升压，升至121 122 （0.11 MPa0.12 MPa）恒温灭菌25 min。降温至（655）时，在超净工作台内将三角瓶中的培养基分装至无菌培养皿中，培养基占培养皿高度的1/31/2。检测 抽取3%5%的试管和培养皿，在28 下培养48 h，无微生物长出为灭菌合格。接种 超净工作台或接种箱紫外灯照射30 min后吹风，之后用75%酒精进行表面消毒。接菌过程严格执行无菌操作，接种后及时贴好标签并做好记录。将3 mm5 mm菌块接种在培养皿或试管培养基的中部，培养皿需用石腊封口膜密封。菌丝长满培养基表面即可使用。培养 在通风避光、22 26 下培养。母种检查 接种后每隔2 d3 d检验一次，挑出菌种未活、污染和生长不良的不合格培培养物，母种感官要求见表1。DB15/T 25422022 4 表1 鸡腿菇母种感官要求 项目 要求 容器 完整、无损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和过滤要求 培养基灌入量 为试管总容积的 1/4，培养皿高度的 1/31/2 菌种外观 菌丝生长量 长满斜面或平板 菌丝体特征 乌白、浓密、旺健 菌丝体表面 均匀、舒展、平整 菌丝体分泌物 无 菌落边缘 整齐 杂菌菌落 无 斜面背面外观 培养基不干缩，颜色均匀，无暗斑、无色素 6 原种、栽培种生产 固体菌种 6.1.1 培养基 粮食培养基：谷粒或麦粒或玉米粒 90%、柠条粉或棉籽壳或木屑或玉米芯粉或豆秸粉 9%，石膏1%，水分含量（502）%，白灰调节 pH 至 67。组合培养基：柠条粉 41%、米糠或麦麸 8%、玉米芯 45%、玉米粉 5%、石膏 1%，水分含量（602）%，白灰调节 pH 至 67；豆秸粉 90%、米糠或麦麸 8%、过磷酸钙 1%、石膏 1%，水分含量（602）%，白灰调节 pH 值至 67；木屑40%、玉米芯49%、米糠或麦麸8%、豆饼粉2%、石膏1%，水分含量（602）%，白灰调节pH值至67。6.1.2 装袋（瓶）采用装袋（瓶）机或人工进行装袋（瓶），人工装袋（瓶）需用打孔器在袋口处打孔，孔直径1 cm1.5 cm、深度为8 cm12 cm，每袋（瓶）装培养基质500 g600 g，塑料袋用无棉盖体套环或窝口海绵塞封口，培养基质装袋（瓶）后4 h内进行灭菌。6.1.3 灭菌 可采用高压灭菌和常压灭菌。高压灭菌：组合培养料在121 122 （0.11 MPa0.12 MPa）下灭菌2 h；粮食培养基在121 122（0.11 MPa0.12 MPa）下灭菌 2.5 h。常压灭菌：在3 h之内使温度升至100，恒温保持10 h12 h。6.1.4 接种 DB15/T 25422022 5 原种、栽培种在超净工作台或接种箱内接种，接种前打开紫外灯照射30 min后吹风，接种时用75%酒精对超净工作台或接种箱进行表面擦拭消毒。每个原种接入2 cm3 cm大小母种12 块；每个栽培种接入原种量不少于15 g。菌种都应从容器口处接种，不应打孔多点接种。每批接种应为单一品种，如中途换品种时采用75%酒精对超净工作台或接种箱及工具进行表面擦拭消毒。6.1.5 培养 通风避光、22 26 下培养。6.1.6 检验 接种后每隔2 d3 d检验一次，挑出菌种未活、污染和生长不良的不合格培培养物。原种感官要求见表2，栽培种感官要求见表3。表2 鸡腿菇原种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、洁净 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（505）mm 菌种外观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 洁白浓密，生长旺健 培养物表面菌丝体 生长均匀、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无、允许少量无色至棕黄色水珠 杂菌菌落 无 子实体原基 无 表3 鸡腿栽培种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损 棉塞或无棉盖体 干燥、整洁、松紧适度、能满足透气和滤菌要求 培养基上表面距瓶（袋）口的距离（505）mm 菌 种 外 观 菌丝生长量 长满容器 菌丝体特征 生长均匀、色泽一致、无角变、无高温抑制线 培养基及菌丝体 紧贴瓶壁、无干缩 菌丝分泌物 无 杂菌菌落 无 子实体原基 允许少量、出现原基种类小于等于5%6.1.7 贮存 DB15/T 25422022 6 原种和栽培种在0 4 下贮存，贮存期不超过50 d。液体菌种 6.2.1 培养基 新鲜无病去皮切片马铃薯 200 g，加水 1200 ml 煮沸 20 min，滤液定容至 1000 ml，加硫酸镁 0.5 g、磷酸氢二钾 1 g、蛋白胨 1 g、酵母粉 1 g、蔗糖 10 g、葡萄糖 10 g，pH 值自然；新鲜无病去皮切片马铃薯200 g，加水1200 ml 煮沸20 min，滤液定容至1000 ml，加入蔗糖20 g，pH值自然。6.2.2 瓶装液体菌种生产 6.2.2.1 装瓶 采用150 ml500 ml三角瓶，培养基添加至刻度的2/3处，用带滤膜的封口膜封口后灭菌。6.2.2.2 灭菌 121 122（0.11 MPa0.12 MPa）湿热保持25 min。6.2.2.3 接种和培养 取3 mm5 mm大小母种1015块接入30 以下的液体培养基中，培养温度在22 26，140 r/min160 r/min下振荡培养6 d10 d。6.2.2.4 检验 接种后第3天对三角瓶逐个进行纯度检验，及时清理未活或污染的培养物并高温处理。6.2.3 菌种罐液体菌种生产 6.2.3.1 装罐和灭菌 将液体培养基装至菌种罐体积的2/3进行灭菌，在121 下灭菌40 min,待液体培养基冷却至30 以下时进行接种。接种方式按照液体菌种罐说明书要求在无菌条件下严格操作。6.2.3.2 接种和培养 将培养好的三角瓶液体菌种接入到菌种罐中，接种量为培养基总体积的8%10%，在22 26，150 r/min160 r/min，灌压0.04 MPa，通风量 0.7 Nm3/h下培养。6.2.4 检测 接种后第3天对罐内培养物进行纯度检验，及时清理未活或污染的培养物并进行高温处理。液体菌种感官要求见表4。DB15/T 25422022 7 表4 鸡腿菇液体菌种种感官要求 项目 要求 容器 完整、无破损、无裂纹 菌丝生长量 培养基 1/21/3 菌丝体特征 白色至透明块状、生长旺健 培养基 清澈、无杂色 杂菌 无 7 入库 检验完成后及时入菌种库，详细记录各生产环节，菌种库温度0 4，避光，适当通风，定期对空间进行杀菌处理。