DB36T 1654-2022 饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程.pdf

ICS 65.020.20 CCS B 35 DB36 江西省地方标准 DB36/T 16542022 饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程 Technical regulations of breeding of chrysanthemum virus-free seed seedlings 2022-09-26 发布 2023-04-01 实施 江西省市场监督管理局 发 布 DB36/T 16542022 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 基本要求.2 5 网室建造与隔离.2 6 原原种繁殖.2 7 原原种鉴定.3 8 原种网室繁殖.3 9 质量检测.4 附录 A（规范性）RNA 病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法.5 DB36/T 16542022 II 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及本专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由江西省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所。本文件主要起草人：汤泳萍、叶艳英、胡文亭、张冰冰、周劲松、尹玉玲、程正新、谢启鑫、罗绍春。DB36/T 16542022 1 饮用菊花脱毒原种苗繁育技术规程 1 范围 本文件规定了饮用菊花（Chrysanthemum morifolium(Ramat.)TzveL.）脱毒原种苗的范围、规范性引用文件、术语和定义、基本要求、网室建造与隔离、原原种繁殖、原原种鉴定、原种网室繁殖、质量检测等要求。本文件适用于饮用菊花脱毒原种苗的生产。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 8321（所有部分）农药合理使用准则 GB/T 51057 种植塑料大棚工程技术规范 GB/T 51183 农业温室结构荷载规范 NY/T 391 绿色食品 产地环境质量 NY/T 496 肥料合理使用准则 通则 NY/T 525 有机肥料 NY/T 1224 农用塑料薄膜安全使用控制技术规范 NY/T 1591 菊花切花种苗等级规格 NY/T 1657 花卉脱毒种苗生产技术规程 香石竹、菊花、兰花、补血草、满天星 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 饮用菊花 Drinkable Chrysanthemum 用于泡饮的多年生草本植物菊的头状花序。3.2 脱毒种苗（virus-free seedlings）经RT-PCR检测方法鉴定，确认脱除了菊花B病毒（CVB）、番茄不孕病毒（TAV）、黄瓜花叶病毒（CMV）等的脱毒核心材料（或脱毒苗）在隔离条件下生产的原原种、原种。3.3 原原种（breeder seed）DB36/T 16542022 2 育种家选育的性状稳定纯正的用于繁殖原种的材料或种苗。3.4 原种（foundation seed）由原原种繁殖的用于繁育生产用种的材料或种苗。4 基本要求 4.1 产地环境 产地环境符合NY/T391的规定。4.2 场地要求 选择排灌方便，地下水位较低，土层深厚、肥沃、疏松，3年内未种过茄科作物、5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。4.3 化学农药使用 应符合GB/T 8321（所有部分）的要求。4.4 肥料要求 应符合NY/T 496和 NY/T 525的要求。5 网室建造与隔离 大棚所有通风处安装60目防虫网。大棚搭建应符合GB/T 51057 和GB/T 51183要求，大棚覆盖薄膜应符合NY/T1224要求。大棚入口处宜配套缓冲间，田间操作人员进入防虫大棚温室、网室应更换工作衣和鞋具。6 原原种繁殖 6.1 材料和培养基准备 选具有繁育品种典型性状、生长健壮的植株，至光照培养箱中采用变温升温的方式进行热处理，在日温/夜温分别为26/20 下培养2d，每2d昼/夜温度分别升高2、直至38/30 下培养40d，取高温培养长出的茎段，剪去叶片，留取心叶或腋芽，放在烧杯中，用肥皂水冲洗干净，再用自来水冲洗1h。滤干，移入无菌操作台，用20%的次氯酸钠灭菌8min10min，取出后用无菌水冲洗35次待用。将制备好的MS+6-BA0.1mg/L培养基溶液分装于培养瓶，每瓶30ml，瓶口盖紧瓶盖。在121，1.1 MPa条件下灭菌20min，冷却后放入无菌操作台待用。6.2 分化和继代培养 在无菌条件下，在解剖镜下剥取已灭菌材料的生长点0.3mm0.5mm，接种到已灭菌的培养基上，置于26，光强2000lx3000lx，光照时间16h/d条件下培养，一周左右茎尖转绿并萌动，20d30d形成带芽茎段。DB36/T 16542022 3 在无菌条件下将已分化的带芽茎段剪成小段，每段带12个腋芽，转入培养基（MS+6-BA0.1mg/L）中进行增殖，34周后获3040个带腋芽芽段。6.3 病毒检测 取继代培养壮芽或叶片提取RNA，经RT-PCR检测方法鉴定，没有病毒宜继续培养，脱毒不彻底应弃之不用。具体操作见附录A。6.4 生根培养、炼苗及移栽管理 6.4.1 生根培养 将继代培养的茎段转入生根培养基（MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L）诱导生根，培养温度2526，34周后95%均生根。6.4.2 炼苗 瓶苗株高6cm7cm，56片平展叶，生根5条以上3cm4cm长的根时即可炼苗，幼苗炼苗1d2d后，定植在营养钵或苗床，于具60目防虫网的防虫网室或防虫温室内进行培育。6.4.3 移栽管理 原原种采用9cm9cm营养钵或苗床移栽，珍珠岩+蛭石+泥炭按体积比111的比例混合做基质，移栽前用广谱保护性杀菌剂喷洒消毒。移栽后浇透定根水，以后保持基质70%的持水量，空气湿度保持在80%90%。太阳光强时要注意采用遮阳网遮荫。当植株发新叶后，逐步恢复自然光照，并进行叶面施肥。气温不足时采取小拱棚膜和大棚相结合的双膜覆盖方式。白天保持2526，夜间1820。成活后白天保持2527，夜间1618，注意控水降温，防止幼苗徒长。移栽前一周注意揭膜通风炼苗。7 原原种鉴定 随机抽取每批次脱毒苗510株，以其母株为对照种植至开花。观察比较其主要生物性状，与母株无差异者则可确认为原原种，有差异则淘汰。8 原种网室繁殖 8.1 环境要求 原种繁育田要求育苗环境除应符合NY/T 391的规定外，要选择排灌方便、地下水位较低，地势高燥，土层深厚、肥沃、疏松，阳光充足，通风条件好，3年内未种过茄科植物、5年内未种过菊科植物的中性或微酸性土壤地块，且周围800m范围内无其它菊科和茄科植物种植。8.2 苗床整理与消毒 8.2.1 苗床整理 育苗地于冬前深耕晒垡，每667平方米施入完全腐熟的农家肥500kg，扦插前一周左右平整土地，清除杂草，畦面做到平、细、碎。育苗畦高25cm30cm，畦面宽100cm，畦间距40cm。苗床四周开宽50cm的深沟，便于排水。DB36/T 16542022 4 8.2.2 苗床消毒 苗床先利用太阳光暴晒消毒，均匀喷洒广谱杀菌剂和灭线剂至畦面上预防杂菌和根结线虫病，再每平方米用茶枯饼0.03kg杀灭地下害虫。在整平的畦面上均匀铺上5cm10cm厚的河沙。8.3 剪顶扦插 原种母株定植行株距应为45cm45cm，从炼苗移栽成活的原原种上取健壮枝条扦插于苗床上，于网室中扩繁。当原种母株长到78片叶时，从基部留34片叶处剪下顶芽进行扦插。8.4 田间管理 在原种基地扩繁种苗应周年进行，当温度低于0时，应搭小拱棚，盖上薄膜保温。当母株苗越冬后，要及时掀开薄膜，中耕除草，松土保墒。苗高7cm8cm时，要开沟施1次复合肥。施用肥料应符合 NY/T 496 和 NY/T 525 规定。具体田间管理参照NY/T 1657操作，经过一年生产和集中繁育，繁育出健壮原种苗。9 质量检测 脱毒原种苗质量检测参照NY/T 1591中5.1.3进行抽样检查，并按照NY/T 1591中5.2的内容进行检测，确定种苗的质量等级。A DB36/T 16542022 5 A B 附 录 A（规范性）RNA 病毒的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法 A.1 主要仪器设备与试剂、耗材 表 A.1 各步骤主要仪器设备与试剂、耗材 步骤/类别 主要仪器设备 主要试剂盒与试剂（试剂均使用分析纯试剂）主要耗材 RNA 提取 高压灭菌锅、电子天平、高速冷冻离心机、微量移液器、微量核酸测定仪 RNA提取试剂盒：TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit 试剂：无水乙醇、液氮 无 RNA 酶的离心管（1.5mL，2mL）、移液器配套枪头、配套枪头盒、研钵、研棒、PE手套、乳胶手套 第一链cDNA合成 水浴锅、制冰机、PCR扩增仪器 反转录试剂盒：PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit 无 RNA 酶 PCR 管 和枪头、乳胶手套 PCR 扩增 PCR 扩增仪器、制冰机 微量移液器、微量离心机 Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)、引物、矿物油 无 RNA 酶 PCR 管 和枪头、乳胶手套 凝胶电泳 电子天平、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统 琼脂糖、1 TAE缓冲液、DNA Marker 三角瓶、量筒、制胶板、梳子、乳胶手套 A.2 操作步骤 A.2.1 菊花总 RNA 的提取 RNA提取按照试剂盒（TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit）Protocol-II的说明书进行。用1.0%的琼脂糖凝胶对总RNA提取结果进行电泳检测，利用微量核酸测定仪检测RNA浓度，测量A260与A280值。A.2.2 第一链 cDNA 合成 按照反转录试剂盒（PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书进行。A.2.3 PCR 扩增及电泳 DB36/T 16542022 6 A.2.3.1 PCR 反应体系 总体积10L，其中0.4L上游引物（10mM），0.4L下游引物（10mM），5L Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)（0.05U/l），1L cDNA模板（20ng/L），3.2Ldd H2O。A.2.3.2 PCR 反应程序 按照以下程序进行：1）94 预变性4min；2）94 变性45s；3）按表A.2 推荐的引物退火温度，退火45s；4）72 延伸45s；5）重复步骤2）4），共35个循环；6）72延伸7min；7）4 保存。A.2.3.3 PCR 扩增产物电泳检测 配制1.0%琼脂糖凝胶，放入电泳槽中，电泳液浸没胶面1mm。样品沿着胶孔边缘匀速加入。接通电源，选择合适的电压和时间电泳。电泳结束后，胶块置于紫外成像系统中，调整拍摄范围和焦距，拍摄成像。A.3 结果判断 RT-PCR检测时，设定阳性和阴性对照，当阳性对照有目标带出现，阴性对照无带时，检测的结果为有效。检测样品有与阳性对照相同的目标带出现时为阳性，无目标带为阴性。表 A.2 菊花病毒的特异性引物 病毒名称 引物序列（5-3）退火温度 产物（bp）菊花B病毒（CVB）P1:ACCGAATTCTTAGTCACAATGCCTCCC P2:TCCGAGCTCATAGAGACGGCATACCGG 55 650 番茄不孕病毒（TAV）P1:CCATCCCTTCAACATCCGACTT P2:GGAGCGTTGAAGCGGAAGGAAT 52 499 黄瓜花叶病毒（CMV）P1:GTAGTGAACGATGTAAACCTGGG P2:GCAGGAACTTTACGAACTGTCAC 59 210 番茄斑萎病毒（TSWV）P1:CTCTGG