SNT 1135.5-2007 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.5一2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法Identification of Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus2007-12-24发布2008-07-01实施中华人民共和国国家质量监督检险检疫总局发布SN/T1135.5-2007马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法1范围SN/T1135的本部分规定了马铃薯环腐病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于所有进出境马铃薯种薯及商品用薯的检疫和鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于SN/T1135的本部分。2.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定在固相支持物上（酶联板）包被细菌特异性抗体，加入待测样品后，再用酶标记的细菌抗体进行免疫识别，最后通过酶促化学反应检测细菌是否存在的一种血清学检测方法。2.2PCR以耐热DNA聚合酶和一对引物（与待测目标核酸分子序列同源的DNA片段）通过高温(DNA分子变性)和低温（引物和目标核酸分子复性并被耐热DNA聚合酶延伸）交替循环扩增待测目标核酸分子的方法。3原理马铃薯环腐病菌(Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus),属厚壁菌门(Firmicutes)厚壁细菌纲(Firmibacteria)棒形杆菌属(Clavibacter),依靠病薯进行远距离传播。寄主及世界分布参见附录A。4仪器和用具4.1仪器设备P仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪。4.2主要试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、氯化镁(MgC2)、dNTPs(dATP、dTIP、dCIP、dGTP)、Taq DNA聚合酶、引物和探针、牛肉汁、酵母膏、磷酸氢二钾(KHPO:)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸镁(MgSO4)、葡萄糖、琼脂，酶联检测试剂见附录B。5病菌的鉴定5.1症状检查取样品量1%一5%（若样品少可适量增大比例）的块茎进行检查。将块茎横切，检查环腐病菌侵染症状，挤压块茎，检查维管组织是否浸解。发病轻者维管束变黄，呈不连续的点状变色：重者整个维管束环变色。病菌也可侵害块茎维管束周围的薄壁组织，呈环状腐烂，严重时可引起皮层与髓部组织分离，轻轻挤压块茎从维管束中涌出奶酪样的柱状物。块茎表面的症状在轻度危害时不明显，随病害发展，皮色变暗或变褐，严重时表皮可出现裂缝。5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（见附录B),若检测结果为阳性，需进行病原