SNT 1569.2-2013 出口河豚鱼中河豚毒素检测方法 第2部分：小鼠生物法.pdf

SN/T1569.2-2013收集上清液，将2次上清液合并并定容至25L,用于小鼠生物试验，根据小鼠注射提取液后的死亡时间，查出鼠单位，并按小鼠体重校正鼠单位，计算确定河豚毒素含量。5.2试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水符合GB/T6682中三级水的要求。5.2.10.5%乙酸溶液：将5mL乙酸(C2H,O2)用水稀释至1L。5.2.2小白鼠：28日龄，体重19g21g的无特定病原体级(SP)昆明系雄性健康小鼠。5.3仪器和设备5.3.1均质器。5.3.2电子天平：感量0.1g。5.3.3离心机：离心力20000g。5.3.4秒表。5.3.5玻璃器皿：烧杯、量简、容量瓶、搅拌棒等。5.3.6一次性注射器：1mL。5.3.7电炉。5.3.8剪刀。5.3.9镊子。5.3.10手术刀。5.3.11微量移液器：1mL。5.4测定步骤15.4.1样品中毒素的提取5.4.1.1冷冻样品装于密封塑料袋内于流水下急速解冻蒸馏水洗净后用滤纸吸干，分解成肌肉组织、肝脏、皮肤等部分，分别称量后将各组织剪碎，充分均质。5.4.1.2对于肌肉组织，准确称取样品10.0g厅50mL离心管中，加人0.5%乙酸溶液11mL,充分混匀，沸水浴中煮沸10min,不断搅拌以防止组织结块5.4.1.3冷却至室温，20000g高速离心20.min,移取上清液于50m离心管中。5.4.1.4向沉淀中加入0.5%乙酸溶液11mL,充分混匀，沸水浴中煮沸5min,不断搅拌以防止组织结块。5.4.1.5冷却至室温，20000g高速离心20mi,取上清液，将2次离心上清液合并混匀，用0.5%乙酸定容至25mL。此提取液1mL相当于原脏器或者组织的0.4g。5.4.1.6肝脏和皮肤的处理方法为：用0.5%乙酸处理后，不需煮沸直接20000g高速离心20min,取上清液，将2次离心上清液合并混匀，用0.5%乙酸定容至25mL。另外，因肝脏中含有大量水分，在加入乙酸提取时，应尽量减少乙酸溶液体积(8L为宜)，以防止TTX提取液稀释倍数过大。注1：制备样品时，如果样品完全解冻，取样时，组织中的毒素有可能会转移到其他组织中。因此，对于冷冻原料，要在半解冻的情况下进行取样操作。制备样品若不能及时检验，应置于4冰箱保存，在24h内检验。注2：作为样品的脏器或者组织不足10g的情况下，按照以上方法进行提取操作，适量减少抽出液。注3：提取液里不含有离心分离液表面上被分离出来的油状物、类似明胶样的物质或者脂质类。5.4.2小鼠毒性试验5.4.2.1选取19.0g21.0g的无特定病原体级(SPF)昆明系雄性健康小鼠6只，称取并记录质量。随机分为实验组和空白对照组2组，每组3只。2