SN 0205-1993 出口蜂产品中四环素族残留量检验方法.pdf

S l中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 2 0 5 一 9 3出口蜂产品中四环素族残留量 检验方法M e t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f t h e r e s i d u e s o ft e t r a c y c l i n e s i n h o n e y p r o d u c t s f o r e x p o r t1 9 9 3 一 0 6 一 0 4 发布1 9 9 3 一 0 s 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布中华人民共和国进出口商品检验行业标准出口蜂产品中四环素族残留量 检验方法M e t h o d f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e r e s i d u e s o f t e t r a c y c l i n e s i n h o n e y p r o d u c t s f o r e x p o r tS x 020 5一 93主题 内容与适 用范围本标准规定了出口蜂产品中四环素族残留量的抽样、制样和微生物检验的方法。本标准适用于出口蜂王浆和蜂蜜中四环素族残留量的检验。抽样和制 样2.，检验批 蜂王 浆以 每一生产缸(约3 0 0 k g)为 一检验批。蜂蜜以不超过 1 0 0 0 件为一检验批。同一检验批的样品，应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 对蜂王浆，每一生产缸取一份样。对蜂蜜，不超过5 0 件包装取5 件，5 1 一1 0 0 件，取1 0 件;1 0 1-5 0 0件，每增加 1 0 0 件，增取 5 件;5 0 1 件及以上，每增加1 0 0 件，增取2件。每件抽取样品不少于 1 0 0 g，作为原始样 品。2.3 抽样工具2.3.1 取样器:不锈钢匙。不锈钢管，长约 1 1 5 c i n、直径约 2.5 c m，或带活塞玻璃管。2.3.2 混样器:搪瓷桶或杯。2.3.3 单套杆:不锈钢制。2.3.4 样品瓶:1 0 0 mL,5 0 0 m L磨砂盖广口玻璃瓶。2.4 抽样方法 蜂王浆:按每缸的上、中、下三个部位抽样，样品混匀后，装 入样品瓶内，标明 标记并及时送实验室冰箱中保存。蜂蜜:按 2.2 的抽样件数随机抽取，逐件开启。将玻璃取样管缓缓放入，吸取样品。如遇蜂蜜结晶时，则用单套杆或不锈钢取样管插到底，抽取样品。将所取样品倾人混样器，混和均匀，装入清洁的样品瓶内，加封后，标明标记，及时送实验室。2.5 试样制备 蜂王浆样品从冰箱中取出后，在室温下融化，搅拌均匀。蜂蜜中未结晶的样品将其用力搅拌均匀，对有结晶析出的样品可将样品瓶盖塞紧后，置于不超过4 0 的水浴中温热，待祥品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。上述蜂王浆及蜂蜜试样均分成两份，装入洁净容器内，密封，并标明标记。2.6 试样保存中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 3-0 6-0 4 批准1 9 9 3-0 8-0 1实施 1S N 0 2 0 5 一9 3蜂王浆:将试祥于一1 8 冷冻保存。蜂蜜:将试样于室温保存。注:在抽样和制徉的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含盘的变化.测定方法3.1 方法提要 蜂王浆样品溶解于三氯乙酸或柠檬酸后，经离心去除样品中的蛋白质，然后用乙醚除去蜂王浆中的癸烯酸等天然抗生物质。通过色谱柱内的 树脂吸 附和解脱.用微生物牛津杯法进行鉴别试验，与标 准比较进行定量。蜂蜜样品经溶解后，直接通过色谱住内的树脂吸附和解脱，以下检验的操作与蜂王浆相同。3.2 试剂和材料 除了特殊规定外，试剂均为分析纯;水为蒸馏水或相应的去离子水，溶液指水溶液。3.2.1 乙醚、甲醇、三氯甲烷以及正己烷。3.2.2 甲醇溶液:6 0 Y.(V/V),3.2.3 柠檬酸缓冲溶液:p H 4.0.3.2.4 三氯乙酸溶液:2%(V/V),3.2.5 柠檬酸溶液:2 Yo(V/V),3.2.6 氯化 铰一 磷酸溶 液:称取1.0 g 氯化按，吸 取2 m L 8 5 0 o 磷酸液，量取1 6 0 m L 蒸馏水配 制而成。3.2.7 氢氧化钠溶液:4 0%(m/二)。3.2.8 磷酸盐缓冲溶液;0.1 m o l/L.P H4.5,p H 8.0.准确称 取1 3.6 g 磷酸二氢钾置于9 5 0 m L水中溶解，用氢氧化钾或磷酸二氢钾调节至p H 4.5 和p H 8.0，然后加水至1 0 0 0 m L.3.2.9 生理盐水:。8 5%的氯化钠溶液.3.21 0 吸附树脂 X A D-2(A mb e r l i t e，苯酚甲醛离子交换树脂)。处理方法:用甲醉浸泡 3 0 m i n以上，然后用水以倾析法洗涤 5-6 次，浸泡于水中备用。3.2-1 1 抗生素标准品:四环素(T C)，土霉素(O T C)，金霉素(C T C)。由国家卫生部药品生物制品检定所规定之标准品。12.1 2 抗生素标准贮备液及工作溶液3.2.1 2.1 抗生素标准贮备液:准确地分别称取。.0 5 0 o g精确至。.0 0 0 1 妇抗生素T C,O T C 和C T C(其 效价为1 0 0 0 单位/m g)，各用。.0 1 m o l/L盐酸溶液溶解后并定容至5 0 m L。抗生素标准溶液为1 0 0 0 p g/m L.配置后在冰箱中保存，在一周内 使用。如抗生 素标准品的效价低于1 0 0 0 单位/m g(1 单泣=1 p g),配制时，则换算为1 0 0 0 单位/m g,3.21 2.2 抗生素标准工作液:在工作时，吸取抗生素标准贮备液，用 p H4.5 磷酸盐缓冲液稀释配制成。.0 5,0.1 0 0-2 0,0.4 0,0.8 0,1-。和2.。)a g/m L的 抗生 素标准工作液。3.2.1 3 色谱用的展开剂 正i-醉二乙蔽十水=4 十1+5或正丁醉+甲醉+水=4+1+23.2-1 4 培养基及菌种制备3.2.1 4:1 菌种用培养基 :了 胰 蛋白 陈 1 0.O g;.，.牛肉开5.0 g;纵化钠2.59;d琼脂1 4.0 -1 6.0 g;s N 0 2 0 5 一 9 3 e.蒸馏水1 0 0 0 mL,制备时，将上述。-d 各组成分加人e 中，搅拌加 热至 溶解。于1 2 1 C，高压灭菌1 5 m i n，最终p H为6.5 士0.1.3.2.1 4.2 检定用培养基 a.胰蛋白陈6.0 g;b.牛肉 膏 1.5 g;c.酵母膏3.0 g;d.琼脂1 4.。一1 6.0 g;e.蒸馏水1 0 0 0 mL,制备时，将上述a-d 各组成分加入e 中，搅拌加热至溶解，经1 2 1 高压灭菌1 5 m i n，最终p H为5.8 士0.1.3.2.1 4.3 试验菌种:蜡样芽抱杆菌(B a c i l l u s C e r e u s V a r my c o i d e s)，菌种号 6 3 3 0 1，由国家卫生部药品生物制品检定所规定的菌种3.2-1 4.4 菌种培养 将菌种安瓶瓶管的上部敲碎后，加入少量肉汤培养基，使其溶解并移至肉汤管中混匀。置于 3 0 士1 培养 2 4 h。取菌种单个菌落接种于菌种培养基中。采用试管斜面或克氏瓶内培养 置于 3 0 士I C 培养1 周。镜检芽抱菌数达到8 5%以上，便可制备芽泡悬浮液。3.2-1 4.5 芽抱悬浮液制备 用适量灭菌的 生理盐水洗下菌苔，于“恒温水浴中加热3 0 m in，再以2 0 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n.弃去上清液，重复2 -3 次。最终用适量的灭菌生理盐水 稀释，即为芽抱悬浮液，置于冰箱中保存使用 有效期为一个月。3.2-1 4.6 平板制备 于灭菌后冷却至 5 0 -5 5 的检定培养基中加人适量的菌液(如抱子悬浮液中的菌数在 1 0，个/mL时，则 按 约。.1%量 加 人;如 果1 0 6 个/m L 时，则 按 约。.5%加 入，使。.0 5 1 g/m L 的士 c 标 准 液 抑 菌 圈 直径达到 1 2 m m),混匀后，立即注人平板。每个平板直接注人检定用培养基 6.0 m L,凝固后备用3-3 仪器和设备3.3.1 培养皿:内径 9 0 m m,底部平整光滑的玻璃皿，或塑料皿上用陶瓦盖.13.2 牛津杯:外径 8 士。.1 m m，内径 6 士。1 mm，高 1 0 士0.1 mm的不锈钢杯，重量误差不超过士0.0 5 g _9 9.9 9 0 o.13.1 8 O t h e r g l a s s w a r e s.14 P r o c e d u r e3.4.1 E x t r a c t io n o f t h e s a mp l e s o l u t i o n14.1.1 E x t r a c t io n o f t h e r o y a l j e l l y s a mp l e 1 0S N 020 5一 93 A c c u r a t e l y w e i g h 5.0 g(a c c u r a t e t o 0.1 g)o f r o y a l j e l l y i n t o a s m a l l b e a k e r,d i s s o l v e i n 8 0 mL o ft r i c h l e r o a c e t i c a c id b y a d d i n g i n s e p a r a t e p o r t io n s.T r a n s f e r q u a n t i t a t iv e l y i n t o t h e c e n t r i f u g e t u b e.c e n t r i f u g a l i z e f o r 1 0 m i n a t 2 0 0 0 r/mi n.P o u r t h e s u p e r n a t a n t i n t o a 2 5 0 mL s e p a r a t i n g f u n-n e t.Di s s o l v e t h e l o we r in s o l u b l e ma t t e r wi t h s u c c e s s iv e 4 0 a n d 2 0 mL o f 2%t r ic h l o r o a c e t i c a c id.a n dc e n t r i f u g a l i z e,c o m b i n e t h e s u p e r n a t a n t s i n t o t h e s e p a r a t i n g f u n n e l.E x t r a c t t h e d e c y l e n i c a c i d wi t h 6 0,6 0 a n d 3 0 m L o f e t h y l e t h e r s u c c e s s i v e l y b y s h a k i n g.D i s c a r d t h e u p p e r e t h e r l a y e r s,c o l l e c t t h e l o w e rl a y e r s o f a q u e o u s s o l u t io n i n a b e a k e r.A d j u s t t h e p H v a l u e o f t h e s o l u t io n t o 4.5 w i t h 4.0%Na O Hs o l u t i o n.a d d 6 0 m L o f p H 4.5 p h o s p h a t e b u f f e r,s t o r e f o r u s e.A l t e r n a t iv e l y,a