SN 0669-1997 出口肉及肉制品中庆大霉素残留量检验方法 杯碟法.pdf

S目中 华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 6 6 9 一 1 9 9 7出口肉及肉制口口D中庆大霉素残留量检验方法杯碟法 Me t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t io n o f g e n t a m y c i nr e s i d u e s i n m e a t s a n d m e a t p r o d u c t s f o r e x p o r t -C y l i n d e r p l a t e me t h o d1 9 9 7 一 0 8 一 1 5 发布1 9 9 8 一 0 1 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发布S N 0 669 一 199 7前言 本标准是根 据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则 第 1 单元:标准的起草与表述规则第1 部分:标准编写的基本规定 及S N/T 0 0 0 1-1 9 9 5 出口 商品中 农药、兽药残留量 及生物毒素检验方法标准编写的基本规定 的要求而进行编写的。其中 测定方法是参考了国内外有关文献，经研究、改进和验证后而制定的。本标准同时制定了抽样和制样方法。测定低限 是根据国 际上对肉 品中 庆大霉素残留量的最高限量和测定方法的 灵敏度而制定的。本标准的附录 A是标准的附录。本标准的附录 B是提示的附录。本标准由中华 人民 共和国国 家进出口 商品检验局提出并归口。本标准由中华人民共和国山东进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人:韩继玲、郑连胜、张铁军、张再生、任怀秀。本标准系首次发布的行业标准。中华人民共和国进出口 商品检验行业标准出口肉及肉制品中庆大霉素残留量检验方法杯碟法s x 0 6 6 9 一1 9 9 7 Me t h o d f o r t h e d e t e r min a t i o n o f g e n t a my c i nr e s i d u e s i n me a t s a n d me a t p r o d u c t s f o r e x p o r t -Cy l i n d e r p l a t e me t h o d范围本标准规定了出口肉及肉制品中庆大霉素残留量检验的抽样、制样和杯碟测定方法。本标准适用于出口鸡肉中庆大霉素残留量的检验。抽 样和制 样2.1 检验批 以不超过 2 5 0 0 件为一检验批。同 一检验批的商品 应具有相同的特 征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1 2 5 1 2 6.1 0 0 5 1 0 1-2 5 0 1 0 2 5 1 5 0 0 1 5 5 0 1 -1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 2 5 0 0 2 02.3 抽样方法 按照2 2 规定的抽样数 量随 机抽取，逐件开启。每件至少 取一袋，作为原始样品。如每件中无小 包装，或有小包装，但每袋重量 超过2 k g 者，则可用灭菌刀具从抽出的包件中割取不少于1 0 0 g，作为原始样品。原始样品总 量不少 于2 k g,混合 后，置于清洁容器内，加封后标明 标记，及时 送交实验室。2.4 试样制备 从所取回的 原始样品中 取出 部分有代表性样品，将可 食部分放人组织捣碎机中 捣碎，充 分混匀。用四分法缩分至 不少于5 0 0 9，装入清洁容 器内，作为试样。加封 后标明标记。2.5 试样保存 将试样于一1 8 以下冷冻保存。注:在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.3 测定方法方法提要中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 7-0 8-1 5 批准1 9 9 8 一 0 1 一 0 1 实施 Is N 0 6 6 9 一1 9 9 7 试样中庆大霉素残留用磷酸盐缓冲液提取，提取液经离心后，取上清液与表皮葡萄球菌作用，用杯碟法进行测定，根据抑菌圈的大小用标准曲线法进行定量。3.2 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.2.1 硫酸庆大霉素标准品:已知 纯度标准品，1 E g 相当于0.6 3 1 p g 庆大霉素，由中国药品生物 制品检定所提供，或等效品。3.2.2 磷酸盐缓冲液:p H 8.。士。.1,称取1 3.3 g 磷酸二氢钾及6.2 g 氢氧化 钾，溶于水中，用水定 容至1 0 0 0 m L。于1 2 1 高压 灭菌1 5 m in,3.2.3 庆大霉素标准储备液:精确称取适量的硫酸庆大霉素标准品，用磷酸盐缓冲 液配制成浓度为1。u g/m L 的标准储备液。保存于4 冰箱中，可使用1 个月。3.2.4 庆大霉素标准工作液:吸取一定量的庆大霉素标准储备液，用磷酸盐缓冲液稀释成庆大霉素浓度为2 0 jA g/m L的中间标准液，再以 此中间 标准液用 磷酸缓冲液稀释成浓度为0.0 5,0.1 0,0.2 0,0.4 0,0.8 0,1-6 0 p g/m L 的庆大霉素标准工作液。以上溶 液均需当日 配制。3.2.5 试验菌种:表皮葡萄 球菌(S t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m id i s)，菌号C M C C 1 2 2 2 8，由中国 药品生物制品检定所提供。3.2.6 培养基 工(见附录A中Al),3.2.7 培养基II(见附录A中A 2),3.2.8 培养基m(见附录A中A 3),3.2.9 生理 盐水:称取8.5 g 氯化 钠，溶解于1 0 0 0 m L 水中，分装后，于1 2 1 C 高 压灭菌 1 5 m in,3.2-1 0 展开剂:三氯甲烷一 甲醇一 浓氨水(1+1+1),3.2 门1 碘片。3.3 仪器和设备3.3.1 培养皿:内径为 9 0 m m，高度为2 0 mm，底部平整、光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦盖。3.3.2 牛 津 杯:不 锈 钢圆 筒，外 径(8.0 士 0.1)m m，内 径(6.0 士 0.1)m m，高(1 0 士 0.1)m m,3.3.3 克氏瓶:8 0 0 m L,3.3.4 游标卡尺:测量范围。-2 0 0 m m，精度。0 2 mm或抑菌圈测量仪I15 均质器:转速不低于1 0 0 0 0 r/m i n e3.3.6 离心机:转速不低于 4 0 0 0 r/min,3.3.7 恒温水 浴锅:0 -1 0 0 C，精度士1 C o3.3.8 恒温培养箱:(3 6 士1.0)C，搁板必须保持水平。3.3.9 高压灭菌器。3.3-1 0 半对数坐标纸。3.3-1 1 旋转蒸发器。3.3-1 2 色谱缸:2 0 c m X 1 5 c m X 3 0 c m,3.3-1 3 薄层硅胶c板:5 c m X 1 0 c m或1 0 c m X 2 0 c m,3.3.1 4 微量注射器:1 0 p L 或2 0 y L,3.4 测定步骤3.4.1 样液制备 称 取l o g 试样(精确至。.I g)于均质杯内，加入1 0 m L 磷酸盐缓冲液(3.2.2)，均质3 m i n(8 0 0 0 r/mi n)后，室温放置6 0 min，移人离心管中离心 3 0 min(4 0 0 0 r/mi n)，取上清液于大试管中，再加人 1 0 ML磷酸盐缓冲液，使与残渣混匀，进行二次离心，合并两次上清液于茄形瓶中，用 1 m o l/L氢氧化钠溶液调p H至8.。士。.1，并用缓冲液定容至2 0 m I，作为待测样液。3.4.2 菌悬液的制备S N 0 6 6 9 一 1 9 9 7 将试验菌种(3.2.5)接种于培养基1(3.2.7)的试管中，经(3 6 士1)培养(2 4 士1)h,移1 m L 菌液于盛有适量培养基1(3.2.6)的克氏 瓶中，使菌液均匀覆盖在琼脂表面，于(3 6 士1)培养(2 4 士 1)h,然后用适量生理盐水将菌苔洗下，备用。置4 冰箱中(不 宜超过1 个月)。3.4.3 检定平板的制备 在测定前，需进行预测试，以 求得菌悬液最佳用量。用0.1 0 f a g/m L 庆大霉素标准工作液对加有不同量的菌悬液的平板进行测试，经培 养后能使。1 0 f a g/m L 标准工作液在平板上 产生直径大于等于1 0mm清晰、完整的抑菌圈的菌悬液用量为最佳用量。将培养基11(3.2.8)熔化.冷却至5 0 左右，加入最 佳用量菌悬液，使其充分混合后，取1 0 m L，注入灭菌培养皿中，保持水平，待其凝固制成检定平板。所用平板需当天制备。3.4.4 标准曲线的制备 用庆大霉素标准工作液(3.2.4)绘制标准曲线，以。2 fa g/m L浓度的标准工作液为参考浓度，以。0 5 fa g/m L 浓度的标准工作液作阴 性对照。每个标准 工作 液浓 度取3 个检定平板作为一组。在每个平板上置6 个牛 津杯，使牛津杯在半径为2.8 c m的圆面上成6 0。角间 距，其中3 个杯中 加满参考浓度的 标准工作液，另三个杯中加满其他浓度的 一种标准工作液。参考浓度溶液与标准工作液要间隔放置。5 个浓度的标准工 作液共计1 5 个检定 平板，用于 绘制标准曲线。这样0.2 fa g/m L 参考浓度标准工作液将得到 4 5 个抑菌圈直径的数值，而其他标准工作液分别得到 9 个抑菌圈直径的数值。盖好皿盖，置(3 6 士1)C 培养(1 7 士 1)h 后，翻转平板，除 去牛津杯。精确测量各 个浓 度的抑菌圈直径(精确到0.1 m m)，求得各自 的平 均值。再求出。.2 f a g/m L参考浓度的4 5 个抑菌圈直径的平均值。用参考浓度的抑菌圈直径的总平均值，与每组平板参考浓度的抑菌圈直径平均值之差，来校正其他各浓度标准工作液的抑菌圈读数的平均值。将校正后的值，按式(1)、式(2)求出L点和H 点。在半对数坐标纸上，以抑菌圈直径(m m)为纵坐标(算术级)，庆大霉素浓度为横坐标(对数级)，标出L和 H 点。通过 L点、H点连一直线，即为标准曲线。L 一;3a 士 2 b 士 二 e.，.，.(1)5 3 e+2 d十 c一 a月=一 一 一5 一一一-.。(2)式中:L 标准曲 线上的最低浓度(0.1 0 p g/m L)抑菌圈直径，m m;H 标准曲线 上的最高浓度(1.6 0 p g/m L)抑菌圈直径，m m;c 参 考浓 度(0.2 0 p g/m L)的4 5 个抑菌直径的平均值，m m;a,b,d,e 分别表示标准曲 线中 其他浓度标准工作液(0.1 0,0.4 0,0.8 0,1.6 0 p g/m L)的抑菌圈直径经校正后的平均值，mm,3礴5 样液的测定 每份样品采用三个检定平 板，在每个检定平板上 置6 个已 灭菌的牛津杯。在每个检定平板上3 个间隔的牛津杯内加满庆大霉素标准参考浓度溶液，另外3 个牛津杯内加满被检样液。将陶瓦盖盖好，置(3 6士 1)C 培养(1 7 士1)h。翻转平板，除去 牛津 杯。如果有抑菌圈产生，精确测量其 直径。I5 结果计算和表述 如样液抑菌圈的平均直径小于 1 0 mm，即报告试样中庆大霉素残留为“阴性”。如样液抑菌圈的平均直径 大于等于1 0 m m，经 校正后，从标准曲线上 查出 相应的 庆大霉素 浓度。按式(3)计算试样中庆大霉素含量。X 一 _cm式中:X试样中庆大霉素残留的含量，m g/k g;(3)c 由 标准曲线上查出的样 液中庆 大霉素浓度，p g/m L;s N 0 669 一 19 97 二 最终试液所代表的试样的浓度，g/m L.注:如测定结果呈阳性。即所显抑菌圈的平均直径大于等于1 0 m m，必要时，尚需进行确证试验(可用薄层色谱法，参见附录B)，以证明抑菌物质确为庆大每素.测定低限和回收率1 测定低限 本方法的测定低限为。.1 0 m g/k g,2 回收率 鸡肉中庆大霉素的添加 浓度及其回 收率的试验数据:0.1 0 m g/k g，回 收率为9 7.7%;0.2 0 m g/k g，回 收率为9 2.5%;0.